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    明膠酶檢測方法研究進(jìn)展

    2012-04-09 01:45:15陳秋鳳周防震
    關(guān)鍵詞:瓊脂糖明膠免疫組化

    陳秋鳳,周防震

    1.湖北民族學(xué)院附屬醫(yī)院(湖北 恩施 445000)2.湖北民族學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院(湖北 恩施 445000)

    明膠酶,亦稱Ⅳ型膠原酶[1]、基底膜性膠原酶[2]等,屬于基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases, MMPs)范疇,包括明膠酶A(MMP-2或稱72kDaⅣ型膠原酶)和明膠酶B(MMP-9或稱92kDaⅣ型膠原酶),可降解Ⅳ型膠原、明膠和V型膠原等基底膜成分,在組織炎癥[3]、纖維化[4,5]、免疫[6]與腫瘤轉(zhuǎn)移[7~9]等諸多過程中發(fā)揮重要作用。明膠酶檢測方法從最初的明膠酶譜法到現(xiàn)在采用的ELISA法,從粗略定性到逐漸發(fā)展為準(zhǔn)確定量,方法穩(wěn)定性、可靠性逐漸完善,操作也變得更為簡單。本文就明膠酶測定方法的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

    1 基于明膠酶催化活性的檢測方法

    利用明膠酶能催化降解明膠的特點(diǎn)發(fā)展建立起來的檢測方法主要有明膠酶譜法(Zymography)、熒光明膠酶法和DQ明膠(Dye-quenched-gelatin)原位酶譜法。

    1.1明膠酶譜法Kleiner等[10]于1994建立此方法,是一種基于非還原SDS-PAGE電泳和反相凝膠染色的蛋白酶檢測方法。主要原理是:1)含明膠酶的樣本首先上樣進(jìn)行非還原SDS-PAGE電泳,利用明膠酶與陰離子去垢劑SDS結(jié)合,形成蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物,使待測蛋白質(zhì)帶上相同的負(fù)電荷,其量大大超過蛋白質(zhì)分子原有的電荷量,因而掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有的電荷差別,此時蛋白質(zhì)分子在凝膠中的遷移率取決于其分子質(zhì)量大??;2)SDS-PAGE電泳后利用含陽離子去垢劑(Triton-x 100)的洗脫液洗脫去除SDS,這一過程中引發(fā)了明膠酶酶原蛋白體外活化機(jī)制,酶原在凝膠內(nèi)除掉一個約10 kDa的小肽,轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘拿竅11],降解凝膠中相應(yīng)部位的明膠。已經(jīng)被激活的明膠酶在去除SDS后也可以恢復(fù)酶活性[12];3)然后經(jīng)過短暫漂洗后將凝膠放入孵育液中進(jìn)行孵育,這時明膠酶分解凝膠中的底物明膠;最后進(jìn)行顯色、脫色后可見藍(lán)色背景下的白色條帶。該方法系最早建立的明膠酶檢測方法,是目前最為常用的明膠酶檢測方法,分為酶原和活化型酶兩種形式,費(fèi)用低、簡便、敏感,適合血漿、組織細(xì)胞蛋白提取物或細(xì)胞培養(yǎng)上清等多種形式樣本的分析,但只能半定量分析MMPs活性,且需要組織勻漿或血清分離等過程,容易導(dǎo)致蛋白降解及部分酶活性丟失,也無法進(jìn)行組織定位觀察。

    1.2 EnzChek熒光明膠酶檢測法Molecular Probes公司于2001推出此方法,是用熒光膠體偶聯(lián)物代替普通明膠而建立起來的一種方法。主要檢測要點(diǎn)是:1)獲得含明膠酶的樣本;2)含膠原酶的樣本與熒光膠體偶聯(lián)物DQ-明膠共孵育,樣本中的明膠酶分解熒光明膠,釋放熒光肽,熒光的增加量與樣本中明膠酶的活性成正比,利用熒光光度計結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線即可定量確定明膠酶的量。該方法將明膠酶的活性與化學(xué)發(fā)光技術(shù)巧妙結(jié)合,具有高敏、快速、方便和直觀等優(yōu)點(diǎn),適合多種形式樣本的分析,特別是適合明膠酶活性抑制劑的高通量篩選。但缺點(diǎn)在于試劑盒費(fèi)用高,且操作過程中仍然需要組織勻漿或血清分離等過程,且無法進(jìn)行組織定位觀察。

    1.3 DQ明膠原位酶譜法該方法既綜合了傳統(tǒng)明膠酶譜法和EnzChek熒光明膠酶檢測法兩種方法的優(yōu)點(diǎn),又克服了形態(tài)定位缺乏之不足,是建立在冰凍切片基礎(chǔ)上進(jìn)行的明膠酶活性分析方法。主要檢測要點(diǎn)是[13]:1)制備組織超薄冰凍切片;2)制備10 g/L的瓊脂糖液,4℃放置備用;3)10 g/L的瓊脂糖液于100℃溫浴至液體析出,吸出瓊脂糖析出液;4)利用瓊脂糖析出液10倍稀釋1 kg/L 的DQ-明膠,充分混勻;5)每片組織超薄冰凍切片滴加50 μL DQ-明膠/瓊脂糖析出液混合液,4℃避光5 min;6)將組織超薄冰凍切片置于反應(yīng)液中,37℃避光孵育8~24 h;7)PBS洗滌和熒光顯微鏡下檢測觀察。

    2 基于明膠酶抗原性的檢測方法

    明膠酶具有大分子蛋白的共性——抗原性,利用此特性發(fā)展建立起來的基于抗原抗體特異結(jié)合的明膠酶檢測體系包括免疫組化分析、Western blot分析和ELISA分析。

    2.1免疫組化分析法該方法是迄今原位檢測組織蛋白最直觀、應(yīng)用最廣的方法,在檢測明膠酶蛋白的試驗(yàn)中,它不僅可以提供各種腫瘤間、各種因子間半定量的比較數(shù)據(jù),更重要的是能象DQ明膠原位酶譜法一樣做到組織定位,從而能夠從形態(tài)學(xué)上反映明膠酶的表達(dá)規(guī)律。田鯤等[14]利用免疫組化的方法,發(fā)現(xiàn)黏液表皮樣癌中明膠酶主要表達(dá)在表皮樣細(xì)胞和中間細(xì)胞,黏液細(xì)胞著色少;腺樣囊性癌中,條索狀實(shí)性區(qū)域上皮細(xì)胞表達(dá)明膠酶強(qiáng)于腺管-篩孔樣區(qū)域,從而認(rèn)為黏液細(xì)胞分化相對成熟,而表皮樣細(xì)胞和中間細(xì)胞分化較低,顯示較強(qiáng)的侵襲活性。但是由于實(shí)驗(yàn)中主觀因素干擾較多導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性較差,如陽性信號的強(qiáng)弱容易受室溫、空氣濕度、溶液離子濃度等因素的影響,各批次著色程度也存在較大差異,另外陽性判斷也因主觀認(rèn)識不一而有所差異。該方法穩(wěn)定性差、不能準(zhǔn)確定量比較,從而限制了其普遍的應(yīng)用。

    2.2 Western blot分析收集含明膠酶樣本(細(xì)胞培養(yǎng)液或組織細(xì)胞蛋白提取液),經(jīng)SDS-PAGE電泳后,轉(zhuǎn)移到NP膜或者PVDF膜,封閉,與一抗(抗MMP-2或MMP-9抗體)及二抗(HRP標(biāo)記)依次孵育,利用ECL試劑盒對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測[15~17]。Western blot分析法,特異性強(qiáng),靈敏度高,選擇合適內(nèi)參可以準(zhǔn)確定量,結(jié)果可靠,但是成本較高,需要購買抗MMP-2或MMP-9抗體、內(nèi)參抗體以及二抗,同時檢測費(fèi)時費(fèi)力,且一次檢測的通量有限。

    2.3酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA) ELISA分析法綜合了Western blot分析法特異性強(qiáng)、靈敏度高和可定量的優(yōu)點(diǎn),同時兼有操作簡單,獲得結(jié)果快,檢測成本低等特點(diǎn),使測定達(dá)到很高的靈敏度和穩(wěn)定性,尤其適合大批量樣本中明膠酶的檢測,以及靶向明膠酶的藥物抑制劑的高通量篩選。但該方法需要價格昂貴的酶標(biāo)儀等多孔板讀板儀。

    3 結(jié)論與展望

    從Kleiner1994年建立明膠酶譜法到現(xiàn)在,明膠酶的測定方法伴隨分子生物學(xué)分析技術(shù)進(jìn)步而不斷更新,目前已有基于明膠酶催化活性和抗原性兩大類6種方法可供選擇。各種方法側(cè)重點(diǎn)不盡相同,免疫組織化學(xué)和DQ-明膠原位酶譜法重點(diǎn)在蛋白的組織定位和半定量;EnzChek熒光明膠酶檢測、Western blot和ELISA幾種方法在嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件的前體下可以做到蛋白定量檢測,而明膠酶譜法則能夠區(qū)分酶原和活化酶。若綜合考慮實(shí)驗(yàn)設(shè)備、技術(shù)手段和經(jīng)費(fèi)預(yù)算等多方面因素,最常用的還是明膠酶譜、熒光明膠酶檢測和免疫組化三種方法。ELISA測定明膠酶的方法,具有快速,高通量和可以準(zhǔn)確定量等優(yōu)點(diǎn),可以動態(tài)檢測組織炎癥、腫瘤等發(fā)生、發(fā)展過程中明膠酶的變化,以及患者在治療過程中明膠酶的變化,將成為臨床早期診斷、治療和預(yù)后的重要檢測手段。

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