蜂毒素促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡作用研究進(jìn)展

侯毅，董自強(qiáng)，張平，龍俊任

(三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院宜昌市中心人民醫(yī)院，湖北宜昌443000)

蜂毒素促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡作用研究進(jìn)展

侯毅，董自強(qiáng)*，張平，龍俊任

(三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院宜昌市中心人民醫(yī)院，湖北宜昌443000)

蜂毒作為一味傳統(tǒng)中藥，其主要的活性及藥理成分是蜂毒素。隨著現(xiàn)代藥理學(xué)的研究，蜂毒素具有一定的抗腫瘤作用，是其多靶點(diǎn)作用于腫瘤細(xì)胞的結(jié)果，本文將主要從蜂毒素促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡作用進(jìn)行綜述。

蜂毒；抗腫瘤；細(xì)胞凋亡

蜂毒作為一味傳統(tǒng)中藥治療疾病由來已久，對于自身免疫性疾病有較好的療效。而當(dāng)今，蜂毒素抑制腫瘤的作用越來越受到人們的重視。蜂毒是由工蜂的毒腺和附屬腺體分泌的一種具有芳香味的透明膠狀毒液，其化學(xué)成分復(fù)雜，主要分三類：多肽類、酶類和非肽類物質(zhì)。約占蜂毒干重50%的蜂毒素是蜂毒的主要組成及活性成分。蜂毒素是分子量為2 840 Da的中性兩性多肽物質(zhì)，由26個氨基酸組成[1]。蜂毒素藥理作用廣泛，具有抗炎鎮(zhèn)痛、廣譜殺菌、抗病毒、抑制血小板凝集、抑制腫瘤和抗艾滋病等多重作用。蜂毒素抗腫瘤是多靶點(diǎn)作用于腫瘤細(xì)胞的結(jié)果，其中促進(jìn)凋亡是其主要抗腫瘤作用之一。

Kerr等在1972年首次提出細(xì)胞凋亡這個名詞，細(xì)胞凋亡是機(jī)體細(xì)胞在正常生理或者病理狀態(tài)下發(fā)生的一種自發(fā)的、程序化的死亡過程，它的發(fā)生受到機(jī)體的嚴(yán)密調(diào)控。本文將主要從蜂毒素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方面來總結(jié)其可能作用的途徑。

1 蜂毒素對細(xì)胞凋亡相關(guān)調(diào)控基因和蛋白的影響

1.1 蜂毒素通過Caspases途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡Caspases即天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶系，在不同的細(xì)胞凋亡因素刺激下，Caspases在細(xì)胞內(nèi)可以通過不同的途徑被活化，目前認(rèn)為其一旦活化，凋亡必將發(fā)生。凋亡起始分子Caspases-9的活化與線粒體密切相關(guān)，Caspase-9在細(xì)胞色素C和dATP的存在先，通過與Apaf-1的CABD結(jié)合形成的復(fù)合體后被活化，繼續(xù)激活下游分子如凋亡效應(yīng)分子Caspase-3，而Caspase-3是Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中最關(guān)鍵的執(zhí)行分子[2-3]，Ahn等[4]研究發(fā)現(xiàn)，蜂毒能誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡，而凋亡的機(jī)制可能是上調(diào)Bax和下調(diào)Bcl-2的蛋白表達(dá)以及活化caspase-3有關(guān)。Moon等[5]在對人白血病細(xì)胞U937與蜂毒素體外試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，一定濃度的蜂毒素能引起B(yǎng)cl-2的降低和Bax的增加，呈時間依賴性，同時隨著蜂毒素的濃度升高，Caspase-3表達(dá)上升，且該表達(dá)受PI3K-AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響。

1.2 蜂毒素對Bcl-2家族蛋白調(diào)控作用Bcl-2是迄今研究的最深入、廣泛的凋亡調(diào)控基因之一，主要分為凋亡抑制蛋白和凋亡誘導(dǎo)蛋白。凋亡抑制蛋白主要有Bcl-2、Bcl-XL和A1/Bf-1等，具有促進(jìn)凋亡的如Bax、Bad和Bak等。Bax和Bcl-2兩者之間的比例在決定細(xì)胞是否發(fā)生凋亡中起著重要作用。李玉梅等[6]用蜂毒素處理骨肉瘤(U2OS)細(xì)胞后，研究證明蜂毒素可增高Bax/Bcl-2比例，由此推斷其后續(xù)的效應(yīng)可能是促進(jìn)Bax-Bax同源二聚體的形成，后者大量定位于線粒體膜，從而誘發(fā)線粒體膜電位轉(zhuǎn)換孔開放及線粒體膜電位耗散，誘導(dǎo)U2OS細(xì)胞凋亡。黃雪強(qiáng)等[7]采用人T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株6T-CEM觀察蜂毒素的促凋亡作用，實(shí)驗(yàn)表明其在殺傷6T-CEM的同時能明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制可能與bcl-2基因表達(dá)明顯下降有關(guān)。

2 蜂毒素對細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響

2.1 蜂毒素對細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)介質(zhì)的影響

2.1.1 蜂毒素對凋亡誘導(dǎo)劑Ca2+的影響Ca2+處于眾多第二信使中的樞紐地位，同時也是一種能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號，Ca2+濃度在凋亡發(fā)生的過程中有明顯的變化。Chu等[8]在人骨肉瘤細(xì)胞MG63體外試驗(yàn)中，蜂毒素能讓對蜂毒素敏感的L-型Ca2+通道開放，促進(jìn)Ca2+內(nèi)流，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，但是運(yùn)用L-型Ca2+通道阻滯劑后，Ca2+內(nèi)流明顯減少，同時大量減少該細(xì)胞株的凋亡，并且這種Ca2+內(nèi)流不依賴PKC和PLA2的活性。Tu等[9]在對黑色素瘤A2058細(xì)胞的研究中證實(shí)：蜂毒素能導(dǎo)致細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高。而運(yùn)用Na+-K+-ATP酶抑制劑和Ca2+螯合劑都能對抗蜂毒素所誘導(dǎo)的凋亡。

2.1.2 蜂毒素誘導(dǎo)神經(jīng)酰胺合成今年來的研究證實(shí)：神經(jīng)酰胺(CM)是一種新的細(xì)胞內(nèi)第二信使，具有激活蛋白激酶、調(diào)節(jié)蛋白的磷酸化和影響磷脂酶A2(PLA2)活性等多種生物學(xué)功能，而且CM被認(rèn)為是引起細(xì)胞生長、分化和凋亡的有效誘導(dǎo)劑。Jayadew等[10]對人白血病細(xì)胞HL-60細(xì)胞研究表明：30 mmol/L TNF-α與HL-60細(xì)胞共同培養(yǎng)15 min后，有10%鞘磷脂水解，而45 min后達(dá)到30%，同時可以誘導(dǎo)花生四烯酸和神經(jīng)酰胺的合成，蜂毒素是PLA2有效激活劑，具有和TNF-α相似的作用，100 μg/ml與HL60細(xì)胞共同培養(yǎng)10 min，有15%～20%鞘磷脂水解，而500 μg/ml作用10min，有30%鞘磷脂水解。

2.2 蜂毒素對細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)信號通路的影響眾所周知，細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長分化和衰老凋亡等生命活動。腫瘤的發(fā)生則是細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)失調(diào)的結(jié)果，對這些失調(diào)的靶點(diǎn)為研究的對象產(chǎn)生的阻滯劑，可能成為新的抗腫瘤藥物。PI3K-Akt和MARK-ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是細(xì)胞內(nèi)兩條重要的促增殖和抗凋亡通路[11-12]。Dong等[13]用0.4～0.8 μg/ml蜂毒素處理血管平滑肌細(xì)胞VSMC細(xì)胞后，通過抑制NF-κB和Akt的活性并可顯著提高促凋亡蛋白表達(dá)，同時降低抗凋亡蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)VSMC細(xì)胞凋亡。Hao等[14]在對蜂毒素引起的感覺和痛覺的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)MAPK通路中的ERK、P38、JNK的表達(dá)受到蜂毒素的影響。Wang等[15]報道蜂毒素能夠通過活化CaMKII-TAK1-JNK/p38途徑并抑制IKK-NF-κB途徑誘導(dǎo)HCC細(xì)胞凋亡，并且能夠通過此種方式增強(qiáng)HCC細(xì)胞對凋亡誘導(dǎo)劑TRAIL的敏感性。蜂毒素作用于細(xì)胞膜后觸發(fā)了PI3K-Akt和MARK-ERK等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，繼而引起Caspase家族和bcl-2家族的變化，誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生，但是中間的具體過程還有待進(jìn)一步的研究。

3 蜂毒素對死亡受體Fas/FasL的影響

死亡受體Fas是隸屬于腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族一員。通過FasL分子通常以三聚體的形式與三個Fas分子進(jìn)行交聯(lián)，引起Fas的死亡結(jié)構(gòu)域(DD)成簇，以DD為中介與Fas相關(guān)的死亡結(jié)構(gòu)域(FADD)，形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合體(DISC)，然后FADD通過其死亡效應(yīng)域與Caspase-8的死亡效應(yīng)域作用，使Caspase-8形成寡聚體并活化，活化的Caspase-8進(jìn)一步活化效應(yīng)Caspase，使細(xì)胞凋亡。張晨等[16]用蜂毒素處理人肝癌細(xì)胞BEL-7402實(shí)驗(yàn)表明，蜂毒素可以增加BEL-7402肝癌細(xì)胞Fas蛋白和Fas的mRNA表達(dá)，但不影響FasL表達(dá)，蜂毒素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞表達(dá)有關(guān)，而FasL無表達(dá)可能與細(xì)胞特性有關(guān)。

4 蜂毒素對細(xì)胞周期的影響

真核細(xì)胞的細(xì)胞周期分為兩部分：間期和分裂期(M期)。間期又包含G1期、S期、G2期，細(xì)胞周期大部分處于間期，G1期是細(xì)胞做出其去向的關(guān)鍵時期。細(xì)胞周期中存在兩個基本調(diào)控點(diǎn)，一個處于G1和S期的過渡時期，其決定細(xì)胞是否進(jìn)入細(xì)胞周期；而另外一個位于G2和M期之間。腫瘤發(fā)生的主要機(jī)制是細(xì)胞調(diào)控異常使腫瘤細(xì)胞具有無限增殖能力，而腫瘤治療的關(guān)鍵就是干擾腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期。宋長城等[17]研究表明蜂毒可以影響人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞周期的正常移行，阻止S期細(xì)胞進(jìn)入G2/M期，造成S期細(xì)胞的集聚，并呈劑量依賴性，其作用機(jī)制可能是干擾細(xì)胞的有絲分裂，阻止細(xì)胞周期，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。吳寶明等[18]研究表明蜂毒素具有較強(qiáng)的抗胃癌細(xì)胞株SGC-7901的活性，可阻滯SGC-7901細(xì)胞于G2/M期，該作用蜂毒素抑制Cdc25-CylinB1-CDK1的mRNA表達(dá)有關(guān)。

5 結(jié)語與展望

蜂毒素在體外實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)取得了比較好的實(shí)驗(yàn)效果。近年來，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，蜂毒素對腫瘤細(xì)胞也有較好的作用。王朋景等[19]研究蜂毒素能明顯抑制人肝癌細(xì)胞HepG-2細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長，其機(jī)制可能是增強(qiáng)裸鼠的免疫能力和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡有關(guān)。秦進(jìn)等[20]研究蜂毒素可以明顯抑制K562細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生長。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也進(jìn)一步的驗(yàn)證了蜂毒素良好的抗腫瘤效果。但是蜂毒素產(chǎn)量少和制備難度大，造成蜂毒素的價格很高，可能限制臨床應(yīng)用，基因工程也在努力解決這個問題。朱文赫等[21]通過原核系統(tǒng)成功表達(dá)蜂毒肽，該蜂毒肽具有和天然蜂毒相同的溶血活性。張紅緒等[22]用能特異結(jié)合肝癌細(xì)胞膜上的小肽SP94與蜂毒素連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體，重組蛋白在大腸桿菌中高效表達(dá)，純化后獲得高純度蛋白。蜂毒素毒性比較明顯，特別是大劑量使用時對正常組織有一定的毒性作用?？聦W(xué)等[23]研究經(jīng)泊洛沙姆188修飾的蜂毒素脂質(zhì)體顯著延長了藥物在大鼠體內(nèi)的駐留時間，提高了藥物的生物利用度，且與膜修飾劑的用量有一定的正相關(guān)性。鐘鐵誠等[24]采用吸附法制備載有蜂毒素的磷酸鈣納米粒切實(shí)可行，其釋放機(jī)制可能是離子交換，其釋放行為具有酸敏性特點(diǎn)，緩釋作用提高了其抑瘤活性?？傊S著對蜂毒素的研究和改造的深入研究，蜂毒素可能成為一種低毒高效的抗腫瘤藥物。

[1]Gevod VS,Birdi KS.Melittin and the 8-26 fragment.Differences in ionophoric properties as measured by monolayer method[J].Biophys,1984,45(6)：1079-1083.

[2]Salvesen GS,Dixit VM.Caspase activation：the induced-proximity model[J].Proc NatlAcad Sci USA.1999,96(20)：10964-10967.

[3]Ivana Scovassi A,Diederich M.Modulation of poly(ADP-ribosylation)in apoptotic cells[J].Biochem Pharmacol,2004,68(6)：1041-1047.

[4]Ahn CB,Im CW,Kim CH,et al.Apoptotic cell death by melittin through of Bax and activation of caspase proteases in human lung carcinoma cells[J].J KorAcup Mox Soc,2004,21(2)：41-45.

[5]Moon DO,Park SY,Choi YH,et al.Melittin induces Bcl-2 and caspase-3 dependent apoptosis through down regulation of Akt phosphorylation in human leukemic U937 cells[J].Toxicon,2008,51 (1)：112-120.

[6]李玉梅,顧偉,李柏,等.蜂毒素誘導(dǎo)人成骨肉瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制探討[J].腫瘤防治研究,2008,35(4)：284-286.

[7]黃雪強(qiáng),凌昌全,陳哲,等.蜂毒素誘導(dǎo)人T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株6T-CEM的凋亡作用[J].安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2001,20(5)：39-41.

[8]Chu ST,Cheng HH,Huang CJ,et al.Phospholipase A2-independent Ca2+entry and subsequent apoptosis induced by melittin in human MG63 osteosarcoma cells[J].Life Sci,2007,80(4)：364-369.

[9]Tu WC,Wu CC,Hsieh HL,et al.Honeybee venom induces calcium-dependent but caspase-independent apoptotic cell death in human melanomaA2058 cells[J].Toxicon,2008,52(2)：318-329.

[10]Jayadev S,Linardic CM,Hannun YA.Identification of arachidonic acid as a mediator of sphingomyelin hydrolysis in response to tumor necrosis factor alpha[J].Biol Chem,1994,269(8)：5757-5763.

[11]Arafael SA,Zhu Q,Barakat BM,et al.Tangeretin sensitizes cisplatin-resistant human ovarian cancer cells through downregulation of phosphoinositide3-kinase/Akt signaling pathway[J].Cancer Res, 2009,69(23)：8910-8917.

[12]Sun CK,Man K,Ng KT,et al.Proline-rich tyrosine kinase 2(Pyk2) promotes proliferation and invasiveness of hepatocellular carcinoma cells through c-Src/ERK activation[J].Carcinogenesis,2008,29 (11)：2096-2105.

[13]Son DJ,Ha DJ,Song HS,et al.Melittin inhibits vascular smooth muscle cell proliferation through induction of apoptosis via suppression of nuclear factor-κB and akt activation and enhancement of apoptotic protein expression[J].JEPT,2006,317(2)：627-637.

[14]Hao J,Liu MG,Yu YQ,et al.Roles of peripheral mitogen-activated protein kinases in melittin-induced nociception and hyperalgesia [J].Neuroscience,2008,152(4)：1067-1075.

[15]Wang C,Chen TY,Zhang N,et al.Melittin,a major component of bee venom,sensitizes human hepatocellular carcinoma cells to tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL)-induced apoptosis by activating CaMKII-TAK1-JNK/p38 and inhibiting IkappaBalpha kinase-NfkappaB[J].Biol Chem,2009,284(6)：3804-3813.

[16]張晨,李柏,呂書勤,等.蜂毒素對人肝癌細(xì)胞線粒體膜蛋白7A6和凋亡相關(guān)基因產(chǎn)物Fas及其配體FasL表達(dá)的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報,2007,5(5)：559-563.

[17]宋長城,呂祥,李柏,等.蜂毒素對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV304生長的影響及機(jī)制探討[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2008,16(2)：163-166.

[18]吳寶明,李俊,呂雄文,等.蜂毒素對SGC27901細(xì)胞生長及G2/ M期阻滯的影響[J].中國藥理學(xué)通報,2010,26(2)：222-225.

[19]王朋景,李俊,黃艷,等.蜂毒素對人肝癌細(xì)胞裸鼠移植瘤生長的影響極其部分機(jī)制[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2011,46(9)：905-908.

[20]秦進(jìn),王春光.蜂毒素對人K562細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤生長的影響[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2011,26(8)：518-522.

[21]朱文赫,田立玲,孫妙囡,等.蜂毒肽基因在大腸桿菌中的表達(dá)、純化及初步鑒定[J].中國生化藥物雜志,2010,31(1)：1-5.

[22]張紅緒,曹靜,周慶峰,等.蜂毒素-SP94雜合基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及蛋白純化[J].河南師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2011, 39(3)：122-125.

[23]柯學(xué),王長江,胡一橋.泊洛沙姆188修飾的蜂毒素脂質(zhì)體在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2010,30(3)：198-201.

[24]鐘鐵成,柯學(xué).載有蜂毒素的磷酸鈣納米粒的制備、表征和體外抑瘤活性研究[J].藥學(xué)進(jìn)展,2011,35(9)：409-416.

R730.52

A

1003—6350（2012）04—111—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.04.051

2011-11-28)

宜昌市科技局醫(yī)療衛(wèi)生科技項(xiàng)目(編號：A01301-12)

侯毅(1984—)，男，土家族，湖北省巴東縣人，在讀碩士。

*通訊作者：董自強(qiáng)，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師。E-mail:dzq8678@yahoo.com.cn