FLAG標(biāo)記的Kir2.3通道的構(gòu)建、表達(dá)及其對(duì)Kir2.3通道功能的影響

趙志英，朱宏謙，張 哲，劉 麗，張國紅

（1.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，教育部血管與神經(jīng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北省新藥藥理毒理研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北石家莊050017；2.河北省公安廳國家安全保衛(wèi)總隊(duì)，河北石家莊050000 3.河北省人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心，河北省老年醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北石家莊050051）

·論 著·

FLAG標(biāo)記的Kir2.3通道的構(gòu)建、表達(dá)及其對(duì)Kir2.3通道功能的影響

趙志英1，朱宏謙2，張 哲3，劉 麗1，張國紅1

（1.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，教育部血管與神經(jīng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北省新藥藥理毒理研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北石家莊050017；2.河北省公安廳國家安全保衛(wèi)總隊(duì)，河北石家莊050000 3.河北省人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心，河北省老年醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北石家莊050051）

目的構(gòu)建FLAG標(biāo)記的內(nèi)向整流鉀通道（inwardly rectifying K channel，Kir）2.3通道蛋白，為進(jìn)一步研究通道的生理功能和調(diào)節(jié)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法運(yùn)用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)，將FLAG標(biāo)記短肽DNA堿基序列插入到Kir2.3通道氨基末端，構(gòu)建重組質(zhì)粒DNA，F(xiàn)LAG-Kir2.3-pGEMHE；采用菌落PCR方法挑取陽性克隆，表達(dá)于非洲爪蟾卵母細(xì)胞，驗(yàn)證加入標(biāo)記后是否影響Kir2.3通道蛋白的功能；進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)，檢測FLAG標(biāo)記短肽表達(dá)情況。結(jié)果經(jīng)測序驗(yàn)證，F(xiàn)LAG-Kir2.3-pGEMHE重組質(zhì)粒DNA構(gòu)建成功，沒有堿基突變。FLAG標(biāo)記短肽沒有影響Kir2.3通道功能，F(xiàn)LAG-Kir2.3成功表達(dá)于非洲爪蟾卵母細(xì)胞，雙電極電壓鉗可以記錄到電流。免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)FLAG標(biāo)記短肽表達(dá)。結(jié)論成功構(gòu)建重組質(zhì)粒DNA，F(xiàn)LAG標(biāo)記短肽已與Kir2.3通道蛋白成功融合并有效表達(dá)。

鉀通道，內(nèi)向整流；聚合酶鏈反應(yīng)；免疫組織化學(xué)

內(nèi)向整流鉀通道（inwardly rectifying K channel，Kir）是在各種組織中廣泛分布的一種鉀離子通道，Kir2.0鉀通道的特征是具有很強(qiáng)的內(nèi)向整流特性，這種通道的整流作用有利于維持細(xì)胞的靜息電位并參與復(fù)極化過程［1］。Kir2.3是Kir2.0家族中的重要一員，已知可以被細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外的信號(hào)分子如Mg2+、多胺、H+、PKC等調(diào)控［2］。研究Kir2.3的調(diào)控機(jī)制對(duì)研究內(nèi)向整流鉀通道家族的調(diào)控機(jī)制有重要意義。FLAG是通用抗原表位標(biāo)記物之一，已廣泛應(yīng)用于蛋白表達(dá)、純化、鑒定、功能研究及蛋白相互作用等領(lǐng)域。本實(shí)驗(yàn)將FLAG標(biāo)簽連接于Kir2.3氨基末端［3］，構(gòu)建重組質(zhì)粒DNA，F(xiàn)LAG-Kir2.3-pGEMHE，為進(jìn)一步研究Kir2.3通道蛋白的生理功能和調(diào)節(jié)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料：Kir2.3 cDNA克隆于質(zhì)粒pGEMHE中，pGEMHE載體質(zhì)粒DNA由美國紐約大學(xué)西奈山醫(yī)學(xué)院（Mount Sinai Medical School）生理學(xué)系Diomedes Logothetis教授惠贈(zèng)。Anti-FLAG M5 monoclonalantibody購自美國Sigma公司，PyrobestTM DNA Polymerase購自日本Takara公司。實(shí)驗(yàn)用非洲爪蟾（Xenopus laevis），購于中科院上海神經(jīng)科學(xué)研究所。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建重組質(zhì)粒DNA：FLAG-Kir2.3-pGEMHE設(shè)計(jì)引物，將FLAG標(biāo)記短肽（DYKDDDDK）插入到Kir2.3-pGEMHE的DNA堿基序列氨基末端，同時(shí)加入酶切位點(diǎn)EcoRI及保護(hù)性堿基，設(shè)計(jì)引物如下，上游引物（50 bp）5' AGGAATTCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGATGCACGGACACAGC 3'，下游引物（24 bp）5' ACCAGATCAAGCTTGCTCTAGAGA 3'。采用高保真DNA聚合酶進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）反應(yīng)，PCR回收產(chǎn)物及載體pGEMHE質(zhì)粒DNA同時(shí)進(jìn)行EcoRI酶切，載體去磷酸化，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后，采用菌落PCR篩選陽性克隆，菌落PCR引物如下，上游引物（24bp）5' TCTTCTCCGCGGCCTTCCTTGTCT 3'，下游引物（24 bp）5'CGGGCAGCACGGTGATCTTACTCT 3'。用BamHI鑒別插入片段方向是否正確［4-5］。經(jīng)測序選取無堿基突變的克隆。

1.2.2 重組FLAG-Kir2.3通道蛋白表達(dá)于非洲爪蟾卵母細(xì)胞：將重組質(zhì)粒DNA和Kir2.3-pGEMHE質(zhì)粒DNA同時(shí)用限制性核酸內(nèi)切酶NheI線性化，用RibomaxTM Large Scale RNA Production Systems-SP6 and T7 Kit試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄得到它們的cRNA。分離爪蟾卵母細(xì)胞，膠原酶消化為單個(gè)細(xì)胞后用ND96清洗細(xì)胞。將FLAG-Kir2.3和Kir2.3 cRNA分別注入爪蟾卵母細(xì)胞，18℃培養(yǎng)。雙電極電壓鉗（two-microelectrode voltage clamp，TEVC）記錄電流是否表達(dá)。灌流液ND96（mmol/L），NaCl 96，KCl 1，MgCl21，CaCl21.8，HEPES 5，用NaOH調(diào)節(jié)pH為7.4；ND96K（mmol/L），KCl 96，NaCl 1，MgCl21，CaCl21.8，HEPES 5，用KOH調(diào)節(jié)pH為7.4。

1.2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)：將表達(dá)帶有FLAG標(biāo)記短肽的Kir2.3通道蛋白的爪蟾卵母細(xì)胞與表達(dá)未帶有FLAG標(biāo)記短肽的Kir2.3通道蛋白的爪蟾卵母細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行4%多聚甲醛固定過夜，PBS清洗3次過夜，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，制成切片，相鄰切片做HE染色和免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)［6］。免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)將切片進(jìn)行抗原修復(fù)，封閉血清封閉，Anti-FLAG M5單克隆抗體4℃過夜，PBS清洗3次，加入辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，37℃45min，PBS清洗3次，DAB顯色，光鏡下觀察是否有陽性表達(dá)及其表達(dá)部位。

2 結(jié) 果

2.1 構(gòu)建重組質(zhì)粒DNA：Kir2.3通道蛋白氨基末端（N末端）在細(xì)胞內(nèi)起始，2次跨膜折疊后羧基末端（C末端）在細(xì)胞內(nèi)終止，N末端較短，C末端較長，且C末端對(duì)通道在細(xì)胞膜的定位與信號(hào)傳導(dǎo)有重要作用。所以我們選擇在Kir2.3通道N末端添加FLAG序列。以Kir2.3-pGEMHE質(zhì)粒DNA為模板DNA，經(jīng)過PCR反應(yīng)，得到的產(chǎn)物片段長度與Kir2.3的堿基數(shù)相似，約為2 000bp（圖1）。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序結(jié)果證實(shí)為目的產(chǎn)物，非假陽性擴(kuò)增。PCR回收產(chǎn)物及載體pGEMHE質(zhì)粒DNA分別用EcoRI酶切并純化。因本次連接反應(yīng)為同源黏末端連接，為了最大程度減少載體自身連接反應(yīng)，減少高背景假陽性克隆，載體必須進(jìn)行去磷酸化。進(jìn)行菌落PCR篩選陽性克隆。在900 bp處有條帶為陽性克隆，無條帶為陰性克?。▓D2），1、3、4、5、6、11、12、13為陽性克隆。挑取其所對(duì)應(yīng)的菌落，進(jìn)行擴(kuò)菌增菌，提取質(zhì)粒DNA，用限制性核酸內(nèi)切酶BamHI鑒別插入片段方向是否正確。因?yàn)槊盖形稽c(diǎn)BamHI在載體pGEMHE和插入片段Kir2.3的DNA序列中都存在，酶切位點(diǎn)BamHI在pGEMHE的DNA序列第83位，在酶切位點(diǎn)EcoRI上方6個(gè)堿基，Kir2.3的DNA堿基數(shù)為1 913，酶切位點(diǎn)BamHI在其DNA序列第1 677位，因此，若為正向連接，BamHI酶切可得2個(gè)片段3 341bp和1 594bp，若為反向連接，BamHI酶切可得2個(gè)片段4 616bp和319bp（圖3），可見3、6、12為正向連接。將連接正確的克隆進(jìn)行測序，篩選無堿基突變的克隆，至此重組質(zhì)粒DNA構(gòu)建成功。

2.2 PMA對(duì)Kir2.3和FLAG-Kir2.3通道電流的作用：將由重組質(zhì)粒DNA和Kir2.3-pGEMHE質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)錄而來的cRNA分別注入卵母細(xì)胞，記錄電流。PMA為PKC激活劑，可以明顯抑制Kir2.3電流。首先在高鉀細(xì)胞外液（ND96K）中，-80mV～+80mV的斜坡電壓記錄電流，圖4A所示為Kir2.3電流及給PMA后電流-電壓曲線變化，圖4B所示為重組通道電流及給PMA后的相應(yīng)電流-電壓曲線變化，最后用ND96外液沖洗以建立零電流基線（ND96外液中，Kir2.3在-80mV電流很?。D4C、D為以上2種通道在給PMA前后電流-時(shí)間變化結(jié)果。虛線為零電流，虛線下曲線為鉗制電壓為-80mV電流，虛線上曲線為鉗制電壓為+80mV電流，結(jié)果顯示0.5μM PMA能夠明顯抑制2種通道電流，抑制率分別為（46.3±5.2）%、（44.8± 6.1）%，PMA對(duì)2種通道的抑制率經(jīng)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。這說明FLAG標(biāo)記短肽未影響Kir2.3通道蛋白表達(dá)及其電流特性，為以后研究Kir2.3通道蛋白的特性和調(diào)節(jié)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)：使用Anti-FLAG M5 monoclonal antibody，可以特異性與FLAG肽段結(jié)合，再加入辣根過氧化物酶耦聯(lián)的二抗，經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)染色，可見表達(dá)FLAG-Kir2.3重組通道蛋白的爪蟾卵母細(xì)胞細(xì)胞膜有棕黃色沉淀顆粒聚集，表達(dá)Kir2.3通道蛋白的爪蟾卵母細(xì)胞細(xì)胞膜卻未見有特異性沉淀顆粒聚集（圖5A，B）。由于Kir2.3通道蛋白是膜蛋白，所以棕黃色沉淀顆粒聚集于細(xì)胞膜，證實(shí)了FLAG標(biāo)記短肽確實(shí)已與Kir2.3通道蛋白成功融合并穩(wěn)定表達(dá)。

3 討 論

DNA重組技術(shù)是一項(xiàng)復(fù)雜龐大的系統(tǒng)工程，簡單地說，它包括4個(gè)大的步驟，目的基因的獲得；目的基因與載體的體外重組；重組后的DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞；轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選和外源基因的表達(dá)?？乖砦粯?biāo)記是一項(xiàng)很有用的技術(shù)，可以鑒定未經(jīng)純化的感興趣的蛋白，能夠使用經(jīng)過很好的鑒定和高度特異性的抗體來研究感興趣的蛋白，不用經(jīng)長時(shí)間費(fèi)力的過程來生產(chǎn)和鑒定抗體。大多數(shù)蛋白可以在一端或其他區(qū)域接受標(biāo)記物，不嚴(yán)重喪失功能。但應(yīng)盡量把表位標(biāo)記物加在靶蛋白的氨基或羧基末端，這樣最可能接近抗體，而最不可能干擾靶蛋白的功能。FLAG是常用的抗原表位標(biāo)記物，可以通過蛋白酶水解切割從靶蛋白中除去，當(dāng)把FLAG序列加在靶蛋白的氨基末端，需要在其堿基序列前加起始密碼子ATG［7］。FLAG作為融合表達(dá)標(biāo)簽，其通常不會(huì)與目的蛋白相互作用并且不會(huì)影響目的蛋白的功能、性質(zhì)，這樣就有利于研究人員對(duì)融合蛋白進(jìn)行下游研究，現(xiàn)FLAG標(biāo)簽已廣泛應(yīng)用于蛋白表達(dá)、純化、鑒定、功能研究及其蛋白相互作用等領(lǐng)域［8］。雖然現(xiàn)在商品化帶有FLAG標(biāo)簽的真核表達(dá)載體很多，但本實(shí)驗(yàn)在非洲爪蟾卵母細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，可以選擇的載體只有pGEMHE，不能用現(xiàn)成的表達(dá)載體，增加了實(shí)驗(yàn)難度。

進(jìn)行抗原表位標(biāo)記的方法很多，常用為PCR，如在PCR引物序列中加入抗原表位堿基序列以及重疊延伸PCR等。本實(shí)驗(yàn)采用方法為在PCR引物中加入FLAG堿基序列，PCR循環(huán)數(shù)應(yīng)盡量少，以減少平臺(tái)效應(yīng)和非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物干擾，減少堿基突變發(fā)生率。為便于克隆，還要在引物兩端加上酶切位點(diǎn)和保護(hù)性堿基。載體與插入片段以相同的限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行切割，形成同源黏末端，這是最方便的克隆途徑。本實(shí)驗(yàn)由于載體質(zhì)粒pGEMHE中酶切位點(diǎn)很少，可以選擇的酶切位點(diǎn)只有EcoRI，故本次試驗(yàn)只能用單酶切進(jìn)行連接，無疑增加了實(shí)驗(yàn)難度。由于本實(shí)驗(yàn)上下游引物所加酶切位點(diǎn)相同，用同一種限制酶剪切形成的載體片段，其兩個(gè)末端的序列是互補(bǔ)的，在連接反應(yīng)中能夠自身連接，恢復(fù)成環(huán)，重新形成原來的載體分子，因此在連接前，必須將線性載體分子進(jìn)行5'末端脫磷酸化處理，使載體分子無法自身連接成環(huán)，而帶有5'端磷酸基團(tuán)的外源DNA片段在DNA連接酶作用下可有效的與去磷酸化的質(zhì)粒DNA連接，形成含2個(gè)缺口的開環(huán)分子，開環(huán)分子的轉(zhuǎn)化效率明顯高于去磷酸化的線狀DNA。因此，脫磷酸化處理后進(jìn)行連接反應(yīng)時(shí)，加大連接酶的用量方能達(dá)到有效連接，減少克隆過程中“空心”克隆產(chǎn)生的數(shù)目。由于有高背景假陽性克隆存在，為陽性克隆篩選增加了很多麻煩，采用菌落PCR擴(kuò)增篩選法，既準(zhǔn)確又簡單、經(jīng)濟(jì)有效［4］。由于此步驟只是篩選故不必用高保真DNA聚合酶。在連接反應(yīng)中適當(dāng)增加插入片段與載體的摩爾比也是行之有效的一種方法。送樣品測序時(shí)要多送幾個(gè)樣品，尤其是本實(shí)驗(yàn)，插入片段為2 000bp，突變幾率大，對(duì)保真性要求高。重組DNA成功表達(dá)于非洲爪蟾卵母細(xì)胞，雙電極電壓鉗記錄電流有表達(dá)，PMA對(duì)FLAG標(biāo)記的重組通道的抑制程度與沒有帶有FLAG標(biāo)記的Kir2.3通道相同［9］。免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)FLAG抗原表位標(biāo)記短肽確實(shí)已與Kir2.3通道蛋白成功融合并有表達(dá)［10］。通過在PCR引物序列中加入FLAG序列所對(duì)應(yīng)的DNA堿基序列，成功構(gòu)建了FLAG-Kir2.3-pGEMHE重組通道，F(xiàn)LAG標(biāo)記穩(wěn)定表達(dá)且未影響Kir2.3通道蛋白功能，為進(jìn)一步研究Kir2.3通道的生理功能和調(diào)節(jié)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。（本文圖見封二）

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（本文編輯：趙麗潔）

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《河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)》編輯部

CONSTRUCTION OF FLAG TAGGED KIR2.3 CHANNEL，ITS EXPRESSION AND FUNCTIONAL STUDY

ZHAO Zhiying1，ZHU Hongqian2，ZHANG Zhe3，LIU Li1，ZHANG Guohong1
（1.Department of Pharmacology，the School of Basic Medical Sciences，Hebei Medical University；The Key Laboratory of Neural and Vascular Biology，Ministry of Education；The Key Laboratory of New Drug Pharmacology and Toxicology，Hebei Province，Shijiazhuang 050017，China；2.National Security Corps，Public Security Department of Hebei Province，Shijiazhuang 050000，China；3.The Clinical Trial Center People's Hospital of Hebei Province；Hebei Provincial Key Laboratory of Geriatrics，Shijiazhuang 050051，China）

ObjectiveFlag tag will be inserted into the upstream of Kir2.3-pGEMHE DNA sequence，which will lay a basis for future research.MethodsThe DNA base sequence corresponding to the amino acid sequence of Flag peptide was inserted into the N-terminus of Kir2.3 by polymerase chain reaction（PCR）.The recombinant plasmid DNA FLAG-Kir2.3-pGEMHE was constructed.The correct clones were chosen by the method of colony PCR and sent for sequencing.Flag-Kir2.3 was expressed in the Xenopus oocytes.The function of FLAG tagged Kir2.3 channel was studied.Immunocytochemistry method was applied to confirm that the Flag-Kir2.3 was expressed on the membrane of the Xenopus oocytes.ResultsAfter examination by sequencing，the Flag tag was found to be inserted into the N-terminus of Kir2.3-pGEMHE.FLAG-Kir2.3 was expressed in the Xenopus oocytes successfully. Channel currents were recorded by two-microelectrode voltage clamp（TEVC）.Immunocytochemistry experiments showed that the Flag tag was fused with Kir2.3 channel protein successfully.ConclusionFLAG-Kir2.3-pGEMHE was constructed by means of PCR successfully.Moreover，the Flag tag did not affect Kir2.3 channel function.These results laid a basis for future research.

potassiumchannels，inwardlyrectifying；polymerasechainreaction；immunohistochemistry

R966

A

1007-3205（2012）12-1365-04

2012-11-12；

2012-12-03

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30900267）；教育部高等學(xué)校博士點(diǎn)新教師基金資助項(xiàng)目（20091323120006）；河北省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)重點(diǎn)指導(dǎo)項(xiàng)目（20090321）

趙志英（1975-），女，河北保定人，河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院副教授，醫(yī)學(xué)博士，從事離子通道藥理學(xué)研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.12.001