溶菌酶的性質(zhì)與應(yīng)用

孫慧君，張 杰

(哈爾濱師范大學(xué))

1 溶菌酶

溶菌酶又稱N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶或胞壁質(zhì)酶［1］，它是一種專門作用于某種目的微生物細(xì)胞壁的糖苷水解酶，主要是通過破壞細(xì)胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的β-1，4糖苷鍵，使細(xì)胞壁中的不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂，內(nèi)容物溢出而使細(xì)菌溶解.因此，溶菌酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用，是近年來科學(xué)家研究探索的又一重點(diǎn).

早在上世紀(jì)初科學(xué)家就已經(jīng)開始了對(duì)溶菌酶的研究，1922年英國(guó)細(xì)菌學(xué)家Alexander Fleming［2］發(fā)現(xiàn)了一種能夠有選擇性的溶解微生物細(xì)胞壁的酶，其大量存在于人的眼淚、唾液中，有較好的溶菌作用，因此把它命名為溶菌酶.此后，人們發(fā)現(xiàn)溶菌酶廣泛存在于高等動(dòng)物組織及分泌物、植物和各種微生物中，而它在新鮮雞蛋中的含量最高，約占3.5%.因此，蛋清也是提取純化溶菌酶的最佳來源.

1.1 溶菌酶的性質(zhì)

溶菌酶是一種糖苷水解酶，在干燥室溫環(huán)境下可以長(zhǎng)期保存，純品為白色或微白色結(jié)晶型或無定型粉末，無臭、味甜、易溶于水，不溶于乙醚、丙酮等［3］，其化學(xué)性質(zhì)非常穩(wěn)定，在pH 4～7范圍內(nèi)，100℃處理10 min仍能保持原酶活性，在堿性環(huán)境中溶菌酶對(duì)熱穩(wěn)定性較差［4］.溶菌酶發(fā)揮溶菌作用的最適pH是在6.5左右，最佳反應(yīng)溫度和進(jìn)行溶菌作用的溫度都要在低于50℃范圍內(nèi)，等電點(diǎn)pH為10.5～11.

現(xiàn)在對(duì)溶菌酶的研究已經(jīng)比較詳細(xì)，在實(shí)際應(yīng)用中，溶菌酶具有抗病毒、抗菌、鎮(zhèn)痛、消腫、加快組織修復(fù)等功能，可用于醫(yī)療，更是一種天然的食品防腐劑，還可以用于提取微生物細(xì)胞內(nèi)各類物質(zhì)和進(jìn)行原生質(zhì)體的制備及融合育種［5］.被WHO與許多國(guó)家認(rèn)定為無毒、無害、安全的添加劑.

1.2 溶菌酶的結(jié)構(gòu)及作用機(jī)理

1.2.1 溶菌酶的結(jié)構(gòu)

對(duì)于溶菌酶的研究最清楚的就是蛋清溶菌酶，它是由18種129個(gè)氨基酸殘基組成單一肽鏈.分子內(nèi)含有4對(duì)S-S鍵.1965年P(guān)hillips等人用X射線衍射法［6］分析了蛋清溶菌酶的三維結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)溶菌酶的分子構(gòu)象近橢圓形，大小為4.5 nm × 3.0 nm × 3.0 nm，其中 α 螺旋僅占25%，在分子的一些區(qū)域有伸展著的β片層結(jié)構(gòu).Alexander等人［7］經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)溶菌酶的內(nèi)部幾乎是非極性的，疏水相互作用在溶菌酶的折疊構(gòu)象中起著非常重要的作用，它的分子表面有一個(gè)能夠容納多糖底物6個(gè)單糖的裂縫，這個(gè)裂縫即為溶菌酶的活性部位，活性中心為天冬氨酸(Asp52)和谷氨酸(Glu35).

1.2.2 溶菌酶的作用機(jī)理

1959—1963年，通過索爾頓、古伊森、讓洛茲等人的研究發(fā)現(xiàn)溶菌酶是主要通過肽鏈中由Glu35和Asp52構(gòu)成的活性中心水解細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖結(jié)構(gòu)，從而殺死細(xì)胞.

肽聚糖是由N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰胞壁酸和幾個(gè)氨基酸短肽聚合成的多層網(wǎng)狀大分子構(gòu)成的，溶菌酶切斷N-乙酰葡萄糖與N-乙酰胞壁酸之間的β-1，4糖苷鍵，Glu35作為糖苷鍵的質(zhì)子供體，剪切底物中的C-O鍵，而作為親核試劑的Asp52參與生成糖基酶中間體.隨后，中間體與水分子發(fā)生反應(yīng)，水解生成產(chǎn)物.使肽聚糖骨架斷裂、細(xì)胞壁損傷、細(xì)胞溶解、最終導(dǎo)致死亡.

溶菌酶不僅僅可以溶解細(xì)菌的細(xì)胞壁，還可以溶解霉菌和酵母菌的細(xì)胞壁，通常根據(jù)溶菌酶作用的對(duì)象不同，將其分為細(xì)菌細(xì)胞壁溶菌酶、霉菌細(xì)胞壁溶菌酶和酵母菌細(xì)胞壁溶菌酶等3大類.

1.3 溶菌酶的溶菌譜

溶菌酶是一種非廣譜抗菌劑，它能夠有效水解細(xì)菌細(xì)胞壁中的肽聚糖，革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁幾乎都是由肽聚糖組成的，而革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁中只有內(nèi)壁層是由肽聚糖組成的，外層是一層脂蛋白.因此溶菌酶對(duì)G+細(xì)菌(如金黃色葡萄球菌、溶壁微球菌)的溶菌作用效果最為顯著，而對(duì)G-細(xì)菌(如埃希氏大腸桿菌)的溶菌作用很弱.

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)通過對(duì)溶菌酶進(jìn)行改性可以改變它對(duì)G-細(xì)菌的抑菌效果，將溶菌酶與其它物質(zhì)如EDTA、有機(jī)酸或nic in合用時(shí)［8］，其抗菌范圍可以擴(kuò)大到其它腐敗性和致病性細(xì)菌以及革蘭氏陰性菌.研究表明，溶菌酶能夠不依賴其酶觸功能而具有進(jìn)一步的抗菌活性 .現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，酶的水解作用可以暴露蛋白質(zhì)的抗菌部分或產(chǎn)生具有抗菌作用的肽，從而提高酶的活性.

2 溶菌酶的應(yīng)用

2.1 溶菌酶在醫(yī)療中的應(yīng)用

2.1.1 溶菌酶具有抗菌消炎、抗病毒、增強(qiáng)免疫力的功效

溶菌酶具有專一性水解細(xì)胞壁的特點(diǎn)，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌具有良好的抗菌作用(如枯草芽孢桿菌、溶壁微球菌等)，對(duì)埃希氏大腸桿菌等革蘭氏陰性菌也具有一定程度的溶菌作用.此外，據(jù)研究將一定比例的溶菌酶與抗菌素混合使用，具有較好的協(xié)同作用，能夠起到抗菌、消炎、祛病強(qiáng)身的作用，因此溶菌酶被廣泛應(yīng)用現(xiàn)代醫(yī)藥行業(yè)中.

溶菌酶是一種堿性蛋白，在體內(nèi)環(huán)境下帶有大量正電荷，能夠與帶有負(fù)電荷的病毒蛋白結(jié)合，與DNA、RNA形成復(fù)鹽，使病毒失去活性.因此，溶菌酶可以被用于預(yù)防及治療一些由病毒引發(fā)的疾病，減輕內(nèi)毒素，從而起到抗病毒的作用.

溶菌酶普遍存在于生物體內(nèi).作為非特異性免疫因子之一，溶菌酶參與機(jī)體的許多免疫反應(yīng)，在機(jī)體的非特異性免疫及正常的防御功能中，具有保持機(jī)體生理平衡、增強(qiáng)機(jī)體免疫能力的重要作用.

2.1.2 溶菌酶可以作為多種疾病的診斷指標(biāo)

1996年Osserman等首次把血清溶菌酶水平的測(cè)定作為白血病分型的依據(jù)，用于診斷急性白血病.

人體的尿液在正常情況下只存在少量的溶菌酶，測(cè)量尿中溶菌酶含量，可以作為診斷腎功能障礙的重要依據(jù).

2.2 溶菌酶在食品中的應(yīng)用

2.2.1 在乳制品和蛋糕中的應(yīng)用

在歐洲，溶菌酶廣泛應(yīng)用于嬰兒食品，人乳和牛乳的主要不同之處，即是其中溶菌酶的含量，人乳中含有大量的溶菌酶，而牛乳中很少.在牛乳制品中添加一定量的溶菌酶，使牛乳制品向人乳轉(zhuǎn)化［9］，改良牛乳品質(zhì)，通過嬰兒吸食牛乳而增強(qiáng)對(duì)病菌的抵抗力，使嬰兒腸道正?；?、成人化，因此將一定量溶菌酶添加到新鮮的牛乳或奶粉中，不但可以起到防腐、保鮮、延長(zhǎng)保質(zhì)期的作用，還有增加營(yíng)養(yǎng)，促進(jìn)嬰兒健康的作用.

在蛋糕、奶油生產(chǎn)中加入一定量的溶菌酶，使它保鮮防霉、有效地延長(zhǎng)保質(zhì)期.

2.2.2 在海產(chǎn)品和水產(chǎn)品保鮮中的應(yīng)用

溶菌酶目前廣泛應(yīng)用于海產(chǎn)品防腐上，通常用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%的溶菌酶、1.5%甘氨酸和3%食鹽溶液中浸漬5 min，瀝干，常溫或冷藏儲(chǔ)存，可延長(zhǎng)海產(chǎn)品的儲(chǔ)存期.

2.2.3 在水果保鮮中的應(yīng)用

將溶菌酶和甘氨酸按照一定比例混合涂抹到水果上，可以有效抑制細(xì)菌在水果表面的生長(zhǎng)繁殖，防止?fàn)€果，增加了水果的保鮮期.

2.2.4 在低溫肉制品中的應(yīng)用

低溫肉制品可以保持天然成分，又使?fàn)I養(yǎng)成分破壞很少，但它的保鮮期短，貨架期短，不能滿足廣大消費(fèi)者需求.溶菌酶無毒、無害可以將一定濃度的溶菌酶溶液噴灑在低溫肉制品上可以起到防腐保鮮的作用［10］.

2.3 溶菌酶在飼料中的應(yīng)用

現(xiàn)在抗生素的濫用，不僅細(xì)菌使產(chǎn)生了耐藥性，更為嚴(yán)重的是藥物在動(dòng)物食品中的殘留，對(duì)人身體的危害也越來越大.因此，溶菌酶這種天然、安全無毒害的抗菌物質(zhì)，越來越多的替代抗生素添加到飼料中改善動(dòng)物的健康狀況.

1996年邵春榮等［11］用自制的溶菌酶粗品添加到飼料中，使仔豬腹瀉下降了22%;同年他又用自制的溶菌酶粗品同樣添加在飼料中，使肉仔雞的成活率提高了14.3% ～17.1%;2002年經(jīng)李曉輝等研究發(fā)現(xiàn)，溶菌酶與免疫球蛋白在功能上有著密切的聯(lián)系，并能與其他活性物質(zhì)互補(bǔ)，增強(qiáng)抗體的活性從而殺滅細(xì)菌.2006年邱偉海在仔豬的日常糧食中添加了500 mg/kg的 溶菌酶，腹瀉率比對(duì)照組的下降了5% ～50%，基本上達(dá)到控制仔豬腹瀉的效果，認(rèn)為溶菌酶可以完全替代抗生素.

2.4 溶菌酶在生物研究中的應(yīng)用

在生物研究中，可以利用溶菌酶專一性水解細(xì)胞壁的特點(diǎn)，了解細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)構(gòu)造;分解細(xì)胞壁后制備的原生質(zhì)體，可用于微生物育種以及微生物分類學(xué)等研究和專用試劑.

近年來，溶菌酶已成為細(xì)胞工程及基因工程項(xiàng)目中必不可少的一種工具酶，用來制造和提取菌體的活性物質(zhì)，如核酸、酶和活性多肽等［12］.

3 結(jié)論

現(xiàn)代社會(huì)，各種有毒有害的污染日益嚴(yán)重“北京咳”“速成雞”等等都嚴(yán)重危害著我們的身體健康，在全社會(huì)大力提倡綠色食品、綠色環(huán)境、綠色生活的今天，溶菌酶以它無毒無害、天然安全的特點(diǎn)引起了人們的廣泛關(guān)注，它具有穩(wěn)定的性質(zhì)，在醫(yī)療、食品和生物研究中都起到了十分重要的作用，廣泛應(yīng)用于我們的生產(chǎn)生活中.

近些年，由于溶菌酶越來越多地被人們認(rèn)可，科學(xué)界也展開了溶菌酶的各方面研究，包括溶菌酶的提取與應(yīng)用等等.據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，通過一系列的生物改良手段已經(jīng)可以在一定程度上擴(kuò)大它的抗菌譜，從而更多更廣的應(yīng)用于我們的實(shí)際生活中.因此，相信隨著科學(xué)研究的不斷深入，溶菌酶的未來將會(huì)有著更廣闊的發(fā)展前景，也將會(huì)更廣泛的為人類所用.

［1］ 景普秋，張復(fù)明.工業(yè)化與城市化關(guān)系研究綜述與評(píng)價(jià)［J］.中國(guó)人口資源與環(huán)境，2003(3):34-39.

［2］ 劉仲敏，何伯安.溶菌酶及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，1995(5):80-82.

［3］ 沈仁泉，顧其敏.生物化學(xué)教程［M］.北京:高等教育出版社，1993.101-105.

［4］ 林親錄，等.雞蛋卵清中溶菌酶的提取與純化［J］.食品科學(xué)，2002(2):43-45.

［5］ 朱奇，陳彥.溶菌酶及其應(yīng)用［J］.生物學(xué)通報(bào)，1998(10):9-10.

［6］ Phillips Perry L J.Disulfide bond engineered into T4 lysozyme:stabilization of the protein toward thermal inactivation［J］.Science，1965，226:555-55.

［7］ Alexander J Exon encode functional and structural units of chicken lysozyme［J］.Pme Natl Acad Sci USA ，1980 ，77(10):57-59.

［8］ Ibrahim H R，Matsuzki T，Aoki T.Genetic evidence that antibacterial activity of lysozyme is independent of its catalytic function.FEBS Letters，2001，506:27-32.

［9］ 盧冬梅，王霆.溶菌酶在口腔疾病者的應(yīng)用.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2006，25(8):777-779.

［10］趙飛龍，徐亞軍.雞蛋清中溶菌酶的應(yīng)用性研究.食品工業(yè)，2006，3:19-20.

［11］自制飼用溶菌酶制劑飼喂肉雞的效果［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，1996(1):57-58.

［12］ Paola Appendini and Joseph H.Hotchkiss.Immobilization of Lysozyme on Food contact Polymers as Potential Antimicrobial Films［M］.Packaging Technology and Science，1997.271-279.