抗C3a多克隆抗體對實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠的療效初探

陳 宇 魏克民 鄭純威 黃 強(qiáng) 李端楊 吳人照

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn's disease，CD)，是一種慢性腸道炎癥，多是由于遺傳易感人群對腸道菌群的異常炎性免疫反應(yīng)所引發(fā)［1］。此病在西方發(fā)達(dá)國家是一種常見病和多發(fā)病。在我國，發(fā)病率雖低于西方，但呈明顯上升趨勢，已成為嚴(yán)重影響人民健康的消化道疾病之一，對其發(fā)病機(jī)制和治療方法的探討一直是免疫學(xué)研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。三硝基苯磺酸(trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS)誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎病理特征與人類炎癥性腸病(尤其是CD)極為相似，是研究IBD的發(fā)病機(jī)制，評價(jià)治療方案的絕佳動(dòng)物模型［2］。其主要發(fā)病機(jī)制為Th1型細(xì)胞因子分泌異常造成結(jié)腸黏膜損傷［3］。

近年來，有研究表明，補(bǔ)體系統(tǒng)參與了許多炎性和免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展［4］。但關(guān)于炎癥性腸病是否存在補(bǔ)體系統(tǒng)的異?；罨约把a(bǔ)體異?；罨c炎癥性腸病的關(guān)聯(lián)性，研究甚少，本文對此問題進(jìn)行了初步的實(shí)驗(yàn)研究。

材料與方法

1.動(dòng)物:BALB/c小鼠，雄性，SPF級，體重18～22g，中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號為SCXK(滬)2007－0005。日本大耳白兔，雌性，體重2.0～2.5kg，購自浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號為SCXK(浙)2006－0025。實(shí)驗(yàn)場地為浙江省中醫(yī)藥研究院，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號為SYXK (浙)2009－0122。

2.試劑:TNBS為Sigma產(chǎn)品，貨號:P2297。C3a、TNF－α ELISA檢測試劑盒購自BD Bioscience公司。MPO檢測試劑盒和蛋白酶抑制劑購自Roche Diagnostics公司。ACD抗凝劑購自美國Baxter公司。

3.抗C3a抗體的制備:C3a多肽序列為IPMRYSCQRRARLITQGENC，將其與噬孔血藍(lán)蛋白(KLH)連接(由杭州中肽公司合成)，免疫日本大耳白兔。每次免疫抗原用量為1mg，采用北部多點(diǎn)皮下注射免疫方式，首次免疫(抗原與完全弗氏佐劑質(zhì)量比為1∶1)后3周加強(qiáng)免疫，以后隔2周免疫(加強(qiáng)免疫時(shí)，抗原與不完全弗氏佐劑質(zhì)量比為1∶1)1次，第3次免疫后14天取血，ELISA檢測血清抗體效價(jià)，并檢測抗體對C3a刺激外周血白細(xì)胞高表達(dá)CD11b生物學(xué)效應(yīng)的影響，評價(jià)其中和活性。所獲得的多抗兔血清經(jīng)硫酸銨飽和沉淀法粗提和蛋白A親和層析柱純化獲得IgG。

4.分組、造模和給藥:BALB/c小鼠隨機(jī)分為對照組(n= 10)，模型組(n=15)，抗C3a抗體預(yù)防組(n=15)，抗C3a抗體治療組(n=15)，潑尼松龍治療組(n=15)。小鼠禁食12h后，腹腔注射速眠新+氯胺酮(速眠新和氯胺酮按1∶1混勻，50微升/只)，待小鼠麻醉后，用帶9號針頭的直徑約0.5cm的硅膠管從肛門插入1cm，注入50μl TNBS溶液，對照組注入50μl 50%乙醇，然后將導(dǎo)管繼續(xù)插入腸內(nèi)至4cm，將100μl上述溶液注入腸內(nèi)，總注入體積為150μl，TNBS劑量為2.5毫克/只。倒置小鼠1min，使藥液達(dá)全結(jié)腸。對照組和模型組腹腔注射兔IgG，抗體預(yù)防組腹腔注射抗C3a抗體，時(shí)間間隔為－2，0，2，5天各注射1次，劑量分別為10、50、100微克/(次·只)?？贵w治療組的注射劑量為50微克/(次·只)，但時(shí)間間隔為2、5天各注射1次。潑尼松龍治療組的腹腔注射劑量為1mg/kg，時(shí)間間隔與抗體治療組相同。每天稱量體重，觀察腹瀉和血便性狀。

5.結(jié)腸病理:分離小鼠結(jié)腸組織，甲醛固定，常規(guī)包埋、切片，蘇木素和伊紅染色，鏡下觀察。

6.結(jié)腸蛋白上清的提取:分離小鼠結(jié)腸組織，剪取其中部分(約1.5cm)，稱重，將蛋白酶抑制劑與結(jié)腸組胺1m l/100mg組織比例混合，用組織勻漿器充分勻漿，將勻漿液轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，11000g，4℃，離心15min，收集上清，凍于 －40℃待測。

7.酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn):小鼠靜脈采血后，ACD抗凝，2000r/min離心10min，收集上清，－40℃保存。實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明進(jìn)行。

8.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示，多組間兩兩比較采用Oneway－ANOVA統(tǒng)計(jì)分析方法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.TNBS腸炎模型建立早期出現(xiàn)明顯的補(bǔ)體活化:補(bǔ)體系統(tǒng)被激活后，形成C3轉(zhuǎn)化酶，將C3裂解成為C3a和C3b。C3a水平的升高反映了補(bǔ)體活化。因此，我們通過檢測C3a水平以驗(yàn)證腸炎建立初期是否存在補(bǔ)體活化。如圖1所示，TNBS腸炎建立后2h，與對照組相比，血漿和結(jié)腸蛋白上清中C3a含量顯著升高。24h時(shí)，血漿中的C3a降至對照組水平，但結(jié)腸組織中的C3a水平仍明顯高于對照組。上述結(jié)果提示，TNBS腸炎建立早期存在明顯的補(bǔ)體活化，補(bǔ)體活化可能是誘發(fā)腸炎的早期事件之一。

圖1 TNBS腸炎模型建立后不同時(shí)間點(diǎn)血漿和結(jié)腸組織中補(bǔ)體C3a表達(dá)水平檢測

2.抗C3a抗體治療有效緩解TNBS腸炎引起的體重下降:為評價(jià)補(bǔ)體C3a在TNBS腸炎中的病理作用，我們制備了抗C3a的多克隆抗體，通過建模前和建模后分別給藥，觀察抗體的治療效果。如圖2所示，與給予兔IgG模型組相比，抗體預(yù)防組小鼠體重下降得到明顯遏制，且療效呈一定的劑量依賴性，且小鼠腹瀉癥狀明顯減輕，血便性狀顯著緩解。更為有意義的是，當(dāng)TNBS腸炎小鼠腹腔注射抗C3a抗體50微克/(次·只)后，小鼠體重降低的癥狀亦得到顯著緩解，腹瀉和血便癥狀明顯減輕，療效與潑尼松龍相當(dāng)。這表明，抗C3a抗體治療可能具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

3.抗C3a抗體治療有效減輕TNBS腸炎對腸道的破壞:觀察期結(jié)束后，分離小鼠結(jié)腸組織，進(jìn)一步觀察抗體治療后腸炎的病理變化。如圖3所示，模型組小鼠結(jié)腸絨毛破壞嚴(yán)重，腺體減少，可見大量炎性細(xì)胞浸潤，而抗體治療組小鼠腸道破壞程度明顯減輕，與潑尼松龍治療組相當(dāng)。人克羅恩病極為相似，是研究克羅恩病病理機(jī)制的理想模型。目前的許多研究主要著重于探究克羅恩病發(fā)展后期導(dǎo)致病理性改變的各種因素，并已取得重要的研究進(jìn)展。但對于誘發(fā)克羅恩病的早期事件研究較少，本研究重點(diǎn)探究了補(bǔ)體活化與實(shí)驗(yàn)性腸炎產(chǎn)生之間的關(guān)聯(lián)性。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了補(bǔ)體活化是TNBS腸炎建立時(shí)的早期事件，并借助抗C3a抗體治療證實(shí)了補(bǔ)體活化可能是一個(gè)重要的促炎因素。鑒于補(bǔ)體C3a是一公認(rèn)的趨化因子，TNBS腸炎建立時(shí)，機(jī)體可通過多種途徑激活補(bǔ)體系統(tǒng)(如經(jīng)典、旁路、凝集素途徑)，產(chǎn)生大量的C3a，從而募集粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等前炎性細(xì)胞等至病灶部位，分泌包括TNF－α在內(nèi)的多種炎性因子，破壞腸道組織，導(dǎo)致腸炎發(fā)生。上述結(jié)果在一定程度上支持這一假設(shè)。

此外，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抗C3a抗體可能具有潛在臨床應(yīng)用價(jià)值。目前，抗C3a的單克隆抗體正在加緊研制中。有意思的是，有文獻(xiàn)報(bào)道，抗C5a抗體可有效緩解體重下降的癥狀，減輕腸道的破壞，此結(jié)論與抗C3a抗體治療一致［8］。但由于補(bǔ)體C5a只在補(bǔ)體活化初期高表達(dá)，過表達(dá)的C5a可與細(xì)胞膜表面的C5a受體相結(jié)合，引起受體內(nèi)化，從而導(dǎo)致體液中C5a含量降低，而C3a的內(nèi)化效應(yīng)并不明顯。因此，有理由推測，相比于C5a，中和C3a可能具有更好的應(yīng)用前景。

4.抗C3a抗體治療下調(diào)TNF－α和MPO的表達(dá):TNF－α是IBD的關(guān)鍵致病因子［5～7］。MPO表達(dá)水平反映了結(jié)腸病灶組織內(nèi)中性粒細(xì)胞的浸潤程度。我們在建模后4天，分離小鼠結(jié)腸組織，提取蛋白上清，檢測TNF－α和MPO的含量。如圖4所示，TNBS腸炎誘導(dǎo)后，結(jié)腸內(nèi)TNF－α和MPO的含量明顯升高。抗C3a抗體治療能有效降低這兩個(gè)因子的表達(dá)水平，這可能是抗C3a抗體治療的機(jī)制之一。

圖4 抗C3a抗體治療下調(diào)TNF－α和M PO的表達(dá)

討論

TNBS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性腸炎病理特征和發(fā)病過程與

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