ICU病區(qū)泛耐藥的鮑曼不動桿菌碳青霉烯類藥物耐藥基因分析

陳士華 魏取好 呂火烊

泛耐藥(pandrug－resistant，PDR)是指分離菌株對臨床常用的絕大多數(shù)抗菌藥物均耐藥的菌株。鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii，AB)特別是泛耐藥的鮑曼不動桿菌(pandrug－resistant Acinetobacter baumannii，PDR－AB)是院內(nèi)定植及導(dǎo)致難治性醫(yī)院感染的主要病原體［1，2］。隨著廣譜或超廣譜抗菌藥物的廣泛及不協(xié)規(guī)范的使用，導(dǎo)致PDR－AB發(fā)生率增高，PDR－AB的耐藥機制復(fù)雜，且多種耐藥機制共存，常見的包括β－內(nèi)酰胺酶特別是碳青霉烯酶的產(chǎn)生、藥物作用靶位的改變、外膜通透性下降及藥物主動外排等等。近年來，研究表明PDR－AB對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥主要其產(chǎn)生多動碳青霉烯類酶，如blaVIM、blaNDM－1和blaIMP和OXA酶，而其中最為多見的為OXA酶。OXA酶可分為4個族，第1族是blaOXA－23，第2族是blaOXA－24，第3族是blaOXA－51和第4族blaOXA－58，其中第1族和第4族是由質(zhì)粒介導(dǎo)，而中間2和3族是由染色體介導(dǎo)［3］。本研究對近2年分離自筆者醫(yī)院的20株P(guān)DR－AB進行了耐藥性及耐藥基因的檢測，現(xiàn)報道如下。

材料與方法

1.菌株來源:2009年1月～2010年12月從筆者醫(yī)院ICU病區(qū)分離的泛耐藥的鮑曼不動桿菌(pandrug－resistant Acinetobacter baumannii，PDR－AB)20株，所有菌株均由Vitek－32全自動微生物鑒定系統(tǒng)鑒定及藥物敏感性試驗篩查。質(zhì)控菌株大腸桿菌ATCC 25922，銅綠假單胞菌ATCC27853購自衛(wèi)生部臨床檢驗中心。

2.儀器與試劑:全自動微生物鑒定系統(tǒng)Vitek－32及配套試劑革蘭陰性桿菌鑒定卡(GNI+);哌拉西林(piperacillin，PIP)、哌拉西林/他唑巴坦(piperacillin/tazobactam，TZP)、頭孢噻肟(cefotaxime，CTX)、頭孢他啶(ceftazidime，CAZ)，頭孢曲松(ceftriaxone，CRO)，頭孢吡肟(cefepime，F(xiàn)EP)，頭孢哌酮/舒巴坦(cefoperazone/sulbactam，CPS)，亞胺培南(imipenam，IMP)，美羅培南(meropenem，MEM)，慶大霉素(gentamycin，GEN)，阿米卡星(amikacin，AMK)，環(huán)丙沙星(ciprofloxacin，CIP)，米諾環(huán)素(minocycline，MIN)，復(fù)方新諾明(trimethoprim－sulfamethoxazole，SXT)和多黏菌素B(polymyxin B，POB)E－試條均購自法國梅里埃公司;PE－9700 PCR儀(美國ABI公司);Eppendorf 5417R高速離心機(德國艾本得); Bio－Rad GelDoc凝膠電泳成像分析系統(tǒng) (美國伯樂公司); MH瓊脂干粉購自英國OXIOD公司;PCR通用試劑盒EmeraldAmpTMPCR Master Mix及DNA分子質(zhì)量標準 DL2000TMDNA Marker均為寶生物工程(大連)有限公司新產(chǎn)品，各種耐藥基因引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，其序列見表1。

表1 PCR擴增基因種類引物序列及產(chǎn)物大小(bp)

3.菌株鑒定及抗菌藥物的耐藥性試驗:按全自動微生物鑒定系統(tǒng)Vitek－32及配套試劑革蘭陰性桿菌鑒定卡(GNI +)使用說明書對菌株進行鑒定;哌拉西林(PIP)、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)、頭孢噻肟(CTX)、頭孢他啶(CAZ)，頭孢曲松(CRO)，頭孢吡肟(FEP)，頭孢哌酮/舒巴坦(CPS)，亞胺培南(IMP)，美羅培南(MEM)，慶大霉素(GEN)，阿米卡星(AMK)，環(huán)丙沙星(CIP)，米諾環(huán)素(MIN)，復(fù)方新諾明(SXT)和多黏菌素B(POB)的耐藥性檢測用濃度梯度法(E－試條法)，其耐藥性解釋標準(除CPS)參照CLSI2011中關(guān)于不動桿菌屬的規(guī)定［4］;CPS的解釋標準參照輝瑞公司建議的標準(MIC值:≤16 S，32 I，≥64 R)。

4.耐藥基因檢測:模板DNA的提取各種靶基因PCR擴增檢測參加文獻進行略作修改［5］。具體為:每反應(yīng)體系P1引物1μl(1.0μmol/L)、P2引物 1μl(1.0μmol/L)，dNTPs 2μl (2mmol/L)，10倍緩沖液2μl［KCl 10mmol/L，(NH4)2SO48mmol/L，MgCl22mmol/L，Tris－HCl(pH9.0)10mmol/L，NP400.5%，BSA 0.02%(wt/vol)］，Taq DNA pol1U(不計體積)，超純水9μl，模板液5μl，總反應(yīng)體積20μl。PCR擴增熱循環(huán)參數(shù)均為:94℃預(yù)變性2min，然后94℃ 60s→50℃ 60s→72℃ 60s，循環(huán)35周期，最后1個72℃延長至5min。產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)與陽性對照分子相當(dāng)?shù)哪康臈l帶為陽性。

結(jié)果

1.抗菌藥物濃度梯度法檢測結(jié)果:20株P(guān)DRAB對PIP、TZP、CTX、CAZ、CRO、FEP、CPS、IMP、MEM、GEN、CIP的耐藥率均為100%;AMK的耐藥率55%，MIN的耐藥率70%，SXT的耐藥率80%，POB的耐藥率為0%;各菌株的詳細結(jié)果見表2。

2.耐藥基因PCR擴增結(jié)果:20株P(guān)DR－AB株，檢測blaOXA－23、blaOXA－24、blaOXA－51、blaOXA－58、blaVIM、blaNDM－1和blaIMP 7種耐藥基因，檢測blaOXA－23、blaVIM和blaIMP基因陽性9株，陽性率45%;blaOXA－23陽性，6株，占陽性菌株中的66.7%(6/9)，分別為1號、5號、6號、9號、12號和17號菌株;blaVIM陽性2株，占陽性菌株中的22.2%(2/9)，分別為2號和15號菌株;blaIMP陽性1株，為19號菌株。20株 PDR－AB PCR擴增blaOXA－23基因電泳結(jié)果見圖1。

表2 20株P(guān)DR－AB對15種抗菌藥物耐藥性的體外檢測結(jié)果

圖1 PCR擴增blaOXA－23基因結(jié)果

討論

ICU病區(qū)由于病人基礎(chǔ)疾病較重，抗菌藥物使用較廣，多耐藥菌株的分離率相對較高。PDR－AB是這些菌株中的典型代表菌，為條件致病菌，近年來已成為醫(yī)院感染的主要病原菌之一，引起的感染逐年增加［6～8］。筆者醫(yī)院ICU分離到的20株P(guān)DR－AB對臨床常用的14種抗菌藥物中的11種全部耐藥，只對阿米卡星(AMK)、米諾環(huán)素(MIN)，復(fù)方新諾明(SXT)3種部分菌株敏感;而對臨床不常用的多黏菌素B，所有菌株均敏感(表2)。對由PDR－AB感染的病人，臨床可綜合考慮選用阿米卡星(AMK)、米諾環(huán)素(MIN)，復(fù)方新諾明(SXT)及多黏菌素B進行治療。

研究表明，PDR－AB對碳青霉烯類藥物的耐藥機制由以下幾個因素引起，一是產(chǎn)生各種碳青霉烯類酶(包括金屬β－內(nèi)酰胺酶)，二是青霉素結(jié)合蛋白(PBPs)的改變，三是通透性的改變(如膜孔蛋白OprD的缺失)，四是主動外泵的增加等，而其中最為主要的因素是產(chǎn)生各種碳青霉烯類酶［9～11］。本研究對20株P(guān)DR－AB主要檢測了blaOXA－23、blaOXA－24、blaOXA－51、blaOXA－58、blaVIM、blaNDM－1和blaIMP 7種碳青霉烯類藥物的耐藥基因。檢測到blaOXA－23、blaVIM和blaIMP基因陽性9株，陽性率45%;其中blaOXA－23陽性，6株，占陽性菌株中的66.7%(6/9);blaVIM陽性2株，占陽性菌株中的22.2%(2/9);blaIMP陽性1株，占陽性菌株中的11.1%(1/9)(圖1)。說明筆者醫(yī)院ICU病區(qū)的PDR－AB可能存在有3種以上的碳青霉烯酶基因，而在這些基因中又以blaOXA－23為主。OXA類酶為Bush分類中的D類(2d)β－內(nèi)酰胺類酶，結(jié)構(gòu)上與C類青霉素結(jié)合蛋白相關(guān)，具有活性絲氨酸位點，能水解碳青霉烯類菌物，不能被克拉維酸抑制。編碼OXA類酶的基因blaOXA可以在染色體上，質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)座子上。目前已發(fā)現(xiàn)140多種OXA類酶。OXA型酶耐藥譜一般較窄，但近年來可水解第3代頭孢菌素和(或)亞胺培南的超廣譜OXA酶不斷被發(fā)現(xiàn)，主要由OXA－2或OXA－10突變衍生而來，其編碼基因通常位于質(zhì)粒或整合子上，具有很強的擴散能力。對鮑曼不動桿菌的研究主要集中在4族突變(blaOXA－23、blaOXA－24、blaOXA－51、blaOXA－58)體上，blaOXA－23為其中的一族(包括blaOXA－23、blaOXA27和blaOXA－49)，由質(zhì)粒介導(dǎo)［3］，易引起傳播，故臨床對分離到此PDR－AB的病人應(yīng)盡快做好隔離。

本研究檢測到另外2型碳青霉烯酶基因blaVIM和blaIMP，均為金屬β－內(nèi)酰胺酶(metallo－betalactamase，MBL)基因，能水解除單環(huán)類抗菌藥外包括碳青霉烯類在內(nèi)的幾乎全部的β－內(nèi)酰胺類抗生素，基因可位于染色體或質(zhì)粒高度可移動遺傳因子上，并可被整合子捕獲，這使得MBLs基因具有可傳播性，MBLs不能被β－內(nèi)酰胺酶抑制劑所抑制，成為治療的一大難題［12，13］。

綜合本研究結(jié)果，筆者醫(yī)院ICU病區(qū)分離的PDR－AB對臨床絕大多數(shù)抗菌藥物耐藥，選用抗菌藥物應(yīng)依據(jù)實驗室的檢測結(jié)果。對碳青霉烯類藥物的耐藥機制檢測表明，筆者醫(yī)院ICU病區(qū)的PDRAB以產(chǎn)blaOXA－23型碳青霉烯類酶為主，其次為blaVIM和blaIMP金屬β－內(nèi)酰胺酶(MBL)，由于這些基因均可在質(zhì)粒上且可被整合子捕獲，因此很容易在菌株或菌屬之間傳播，因此臨床加強對此類菌的監(jiān)測及預(yù)防隔離工作。

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