Rh IL－21對NK－92M I細(xì)胞生物學(xué)活性的影響

鄭 瑞 陳葆國 顏衛(wèi)華 李伯利 章衛(wèi)國 干靈紅

IL－21主要是由活化的CD4+T細(xì)胞和NKT細(xì)胞分泌，屬于γc(共同γ鏈)細(xì)胞因子家族成員之一［1～3］。至今有不少關(guān)于白介素(IL)－21對鼠和人NK細(xì)胞生物學(xué)調(diào)節(jié)的研究。曾發(fā)現(xiàn)IL－21和IL－15體外共同培養(yǎng)的鼠NK細(xì)胞，其增殖受到抑制，IL－21也并非NK細(xì)胞早期成熟必須的細(xì)胞因子［4］。IL－21可以通過增強(qiáng)鼠NK細(xì)胞殺傷活性對NKG2D配體陽性的腫瘤細(xì)胞有抑制作用，但也有研究表明IL－21通過下調(diào)人primary NK和CD8+T細(xì)胞表面NKG2D/DAP10的表達(dá)，而抑制primary NK細(xì)胞通過NKG2D介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用［5，6］。可見IL－21對NK細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)可能因種群差異存在差異。因此本文通過rhIL－21對NK－92MI細(xì)胞生物學(xué)活性調(diào)節(jié)的研究，進(jìn)一步探討IL－21對NK細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用。

材料與方法

1.材料:rhIL－21及Human IFN－γMini ELISA Development Kit購自美國PeproTech公司，細(xì)胞毒活性檢測試劑盒CytoTox 96?Non－Radioactive Cytotoxicity Assay購自美國Promega公司，PE標(biāo)記鼠anti－h(huán)NKG2D購自R＆D公司，TRizol Reagent購自美國Invitrogen公司，Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit購自加拿大Fermentas(MBI)公司，凋亡檢測試劑盒購自聯(lián)科生物 AnnexinV/PI apoptosis kit，胎牛血清、新生牛血清、馬血清、RPMI－1640及α－MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基均購自美國GIBCO公司。引物由上?；凳巧锛夹g(shù)有限公司合成。NK－92MI細(xì)胞(惡性非霍奇金淋巴瘤患者外周血NK細(xì)胞系NK－92經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染hIL－2后得到)及K－562細(xì)胞(人慢性髓系白血病細(xì)胞系)均為本室保存。

2.細(xì)胞培養(yǎng):NK－92MI細(xì)胞培養(yǎng):在α－MEM培養(yǎng)基中加入終濃度為12.5%的胎牛血清和12.5%的馬血清，于37℃、含5%CO2和95%濕度的孵箱常規(guī)培養(yǎng);K－562細(xì)胞培養(yǎng):于RPMI－1640培養(yǎng)基中加入10%的新生牛血清，常規(guī)傳代培養(yǎng)。

3.細(xì)胞增殖試驗:取處于對數(shù)生長狀態(tài)良好的NK－92 MI細(xì)胞，1200r/min×4min，離心。PBS洗1次，1m lα－MEM完全培養(yǎng)基懸起細(xì)胞，計數(shù)。調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/ml，備用。按rhIL－21藥物濃度實驗分4組，分別為0ng/ml，25ng/ ml，50ng/ml和100ng/ml組。配備含200ng/m l rhIL－21的α－MEM完全培養(yǎng)基1ml(取2μl100ng/μl的rhIL－21加入到1mlα－MEM完全培養(yǎng)基)于96孔板實驗各孔加入100μl的α－MEM完全培養(yǎng)基，取含200ng/ml rhIL－21的α－MEM完全培養(yǎng)基加入到第一組各孔，100微升/孔。輕混勻后分別取100微升/孔加入下一個稀釋度的各孔依次倍比2稀釋，3復(fù)孔/稀釋度，取NK92 MI細(xì)胞懸液100μl加入各相應(yīng)孔。將96孔板置37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，分別在24、48和72h 3個藥物培養(yǎng)時間段收集細(xì)胞并計數(shù)。

4.細(xì)胞毒效應(yīng)試驗:取生長狀態(tài)良好NK－92MI細(xì)胞，PBS洗滌兩次后，于100ml培養(yǎng)瓶中按2×105個/ml細(xì)胞濃度培養(yǎng)，一組加入終濃度為50ng/ml rhIL－21，一組未加藥物，在37℃、含5%CO2的孵箱常規(guī)培養(yǎng)48h。收集預(yù)處理后細(xì)胞，PBS洗滌3次，把兩組細(xì)胞濃度調(diào)為4×106個/毫升備用。取U型底96孔板，按CytoTox 96?Non－Radioactive Cytotoxicity Assay試劑盒操作步驟，設(shè)靶細(xì)胞自然釋放孔、培養(yǎng)基背景孔、靶細(xì)胞最大釋放孔、體積校正孔及效應(yīng)細(xì)胞自然釋放孔。取準(zhǔn)備好的NK－92MI細(xì)胞加入96孔板，以倍比稀釋法設(shè)立6個效應(yīng)細(xì)胞濃度梯度，體積50微升/孔。再取準(zhǔn)備好的生長狀態(tài)良好的靶細(xì)胞K－562(2×105個/毫升)50μl加入到相應(yīng)各孔，使效靶比分別為20∶1、10∶1、5∶1、2.5∶1、1.25∶1共5個濃度梯度，每個梯度4個復(fù)孔。在37℃、含5%CO2的孵箱常規(guī)培養(yǎng)4h后，以每孔10μl裂解液加入到靶細(xì)胞最大釋放孔和體積校正孔，再孵育45min后，取出250g×4min離心，收集上清50微升/孔，移入另一平底96孔板，再加入反應(yīng)液50微升/孔，避光室溫孵育30min，490nm讀取吸光度值。通過檢測上清中LDH含量計算NK－92MI對K－562細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。細(xì)胞毒效應(yīng)計算公式:細(xì)胞毒(%)=(實驗組－效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放－靶細(xì)胞自發(fā)釋放)/(靶細(xì)胞最大釋放－靶細(xì)胞自發(fā)釋放)×100%。

5.流式細(xì)胞術(shù)(FACS)檢測:以50ng/m l rhIL－21預(yù)處理NK－92MI細(xì)胞48h，同時設(shè)PBS對照組(即未加藥組)。收集細(xì)胞用PBS洗滌兩次，離心后，用300μl PBS重懸細(xì)胞混勻，平分為3管，一管加入anti－IgG－PE/IgG－FITC同型對照熒光標(biāo)記抗體，一管加入anti－Granzyme B－PE熒光標(biāo)記抗體，另一管加入anti－h(huán)NKG2D－PE熒光抗體，室溫孵育30min，PBS洗滌兩次，細(xì)胞用500μl PBS懸起，上機(jī)分析。同樣方法培養(yǎng)細(xì)胞48h和72h，按AnnexinV/PIapoptosis kit操作步驟檢測rhIL－21對NK－92MI細(xì)胞凋亡影響。

6.RT－PCR檢測目的基因的表達(dá):分時收集50ng/ml預(yù)處理0、6、12和24h的NK－92MI細(xì)胞，PBS洗滌2兩次，細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，每次取同等量細(xì)胞，用TRizol試劑盒抽取細(xì)胞總mRNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)取2μl mRNA，總體系為20μl，合成cDNA。PCR反應(yīng)體系為25μl:2.5μl 10×Buffer，1.5μl 25mmol/L MgCl2，0.5μl dNTP，0.5μl cDNA，各0.5μl上下游引物，0.5μl Taq DNA聚合酶，18.5μl去離子水。反應(yīng)條件:94℃10min; 94℃1min、56℃45s、72℃45s共38個循環(huán);72℃min;4℃ Hold。取4μl PCR產(chǎn)物用1.3%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果用Quantity one軟件進(jìn)行灰度分析，對目的基因進(jìn)行半定量。各引物如表1。

表1 各PCR引物序列及擴(kuò)增片段長度

7.ELISA 檢測IFN－γ的分泌:試驗于96孔板中進(jìn)行，檢測50ng/m l rhIL－21藥物在不同時間對NK－92MI細(xì)胞分泌IFN－γ的影響。體積為200微升/孔，每個時間梯度(12h，24h和48h)3個復(fù)孔，同時設(shè)培養(yǎng)基(含12.5%胎牛血清和12.5%馬血清的α－MEM)和常規(guī)NK－92MI細(xì)胞培養(yǎng)對照組，于37℃、含5%CO2的孵箱培養(yǎng)。按 Human IFN－γMini ELISA Development Kit實驗步驟進(jìn)行，檢測490nm吸光度值。

8.統(tǒng)計學(xué)方法:所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料描述用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示，統(tǒng)計分析前各組數(shù)據(jù)均進(jìn)行方差齊性檢驗，多組間數(shù)據(jù)比較采用One－way ANOVA方差分析，組間兩兩比較采用LSD統(tǒng)計方法，兩組間比較采用兩組間獨立樣本t檢驗(細(xì)胞殺傷實驗采用配對資料t檢驗)，P＜0.05為差異具有顯著性。

結(jié)果

1.RhIL－21對NK－92MI細(xì)胞增殖的影響:實驗數(shù)據(jù)顯示，隨培養(yǎng)時間的延長實驗組及對照組細(xì)胞均有不同程度的增殖(One－way ANOVA方差分析，結(jié)果顯示各組P均＜0.05)。同時觀察到隨培養(yǎng)時間的延長各組之間細(xì)胞的增殖并不同步，實驗組較對照組細(xì)胞生長緩慢，特別是在培養(yǎng)72h之后，差異更為顯著(P=0.000)，可見rhIL－21抑制了NK－92MI細(xì)胞的正常增殖，但并未看到呈藥物濃度梯度依賴性抑制，統(tǒng)計學(xué)顯示各實驗組之間差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果如表2所示。

表2 不同濃度rh IL－21對NK－92M I增殖的影響

2.rhIL－21對NK－92MI細(xì)胞凋亡的影響:鑒于結(jié)果1所示，不同劑量rhIL－21對NK－92MI細(xì)胞的增殖有不同程度的抑制，我們選擇既能發(fā)揮藥效又不至于過度抑制細(xì)胞生長的劑量(50ng/ml)進(jìn)行后續(xù)試驗研究。在50ng/ml rhIL－21培養(yǎng)NK－92MI 48h和72h后，Anexin V和PI染色顯示，實驗組和對照組細(xì)胞凋亡率的差別無統(tǒng)計學(xué)意義(48h，P=0.947; 72h，P=0.325)，且不隨培養(yǎng)時間的延長而增加，即50ng/ml rhIL－21并未增加NK－92MI細(xì)胞的凋亡。結(jié)果如表3所示。

表3 rh IL－21對NK－92M I凋亡的影響(%)

3.rhIL－21對NK－92MI細(xì)胞細(xì)胞毒效應(yīng)的影響:以50ng/ml濃度的rhIL－21預(yù)處理NK－92MI 48h后，觀察NK－92MI細(xì)胞毒效應(yīng)的改變。結(jié)果顯示在效靶比為5∶1、2.5∶1、1.25∶1時，50ng/ml能增強(qiáng)NK－92MI細(xì)胞的細(xì)胞毒活性(P＜0.05)。結(jié)果如圖1所示。

圖1 rh IL－21對NK－92M I細(xì)胞毒效應(yīng)的影響

4.rhIL－21對NK－92MI細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響:RT－PCR結(jié)果顯示，50ng/ml rhIL－21能夠促進(jìn)NK細(xì)胞細(xì)胞毒效應(yīng)相關(guān)基因如顆粒酶－B (274bp)、穿孔素(511bp)、IFN－γ(339bp)以及NK細(xì)胞表面活化型受體NKG2D基因(416bp)mRNA的表達(dá)，且均呈時間依賴性表達(dá)增強(qiáng)(P＜0.05)，見圖2，用Quantity one軟件分析目的基因與β－actin的灰度比值見表4。

圖2 RT－PCR鑒定NK－92M I細(xì)胞活化相關(guān)基因表達(dá)

5.rhIL－21對NK－92MI細(xì)胞表面NKG2D受體及胞質(zhì)顆粒酶－B蛋白的調(diào)節(jié):50ng/m l rh IL－21處理NK－92MI細(xì)胞48h后，細(xì)胞表面NKG2D受體的平均熒光強(qiáng)度及胞質(zhì)顆粒酶－B蛋白的表達(dá)均明顯增強(qiáng)(NKG2D，P=0.00;顆粒酶－B，P=0.00)，如圖3及表5所示。

表4 不同時間目的基因的表達(dá)量變化

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測NK－92M I細(xì)胞表面NKG2D受體及胞內(nèi)顆粒酶－B的表達(dá)

表5 NKG2D及顆粒酶－B蛋白平均熒光強(qiáng)度的變化

6.rhIL－21對NK－92MI細(xì)胞IFN－γ分泌的影響:根據(jù) ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線公式(y=755.81x2－721.46x+139.66，r2=0.9551)計算相應(yīng)吸光度值對應(yīng)的IFN－γ濃度。隨培養(yǎng)時間的延長，兩組細(xì)胞分泌IFN－γ水平均有升高(實驗組P=0.000，對照組P=0.000)。但與對照組比較，50ng/ml rhIL－21藥物處理組細(xì)胞分泌IFN－γ的能力在24h和48h時，均明顯高于對照組(24h P=0.020，48h P=0.002);而在12h時兩組相比，分泌IFN－γ水平無顯著性差異(P=0.173)，如圖4所示。

圖4 50ng/m l rh IL－21對IFN－γ分泌的影響

討論

自Parrish－Novak等［1］報道IL－21對NK細(xì)胞的研究以來，有較多關(guān)于IL－21對人及鼠NK細(xì)胞增殖、免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤效應(yīng)等各方面的研究。針對IL－21對NK細(xì)胞增殖的研究，有報道表明IL－21能抑制IL－15或IL－2活化的鼠NK細(xì)胞的增殖，并能促使NK細(xì)胞通過經(jīng)典的凋亡途徑發(fā)生凋亡［4，7］。雖然種屬不同，但與本研究rhIL－21能不同程度抑制NK－92MI細(xì)胞增殖的結(jié)果相近。然而這種生長抑制不是NK－92MI細(xì)胞凋亡率增加的結(jié)果，本研究并未發(fā)現(xiàn)rhIL－21培養(yǎng)組和對照組在NK－92MI生長48h后，Annexin V+/PI+雙陽性細(xì)胞百分率的差異。這同Skak等［8］報道的，IL－21能促進(jìn)人外周血純化的NK細(xì)胞的存活率結(jié)果相吻合，或者至少證明了IL－21不會促進(jìn)人NK細(xì)胞的凋亡。

作為具有天然抗腫瘤活性的NK細(xì)胞，其細(xì)胞毒效應(yīng)可受多種細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)。研究IL－21對NK細(xì)胞細(xì)胞毒效應(yīng)的影響，是IL－21對NK細(xì)胞各種免疫調(diào)節(jié)的綜合體現(xiàn)。本研究結(jié)果表明50ng/ml濃度的rhIL－21均能顯著增強(qiáng)NK－92MI細(xì)胞對靶細(xì)胞K－562的細(xì)胞毒效應(yīng)，這與Skak等［8］的研究結(jié)果一致，盡管也有其他研究結(jié)果與此不同，但多數(shù)研究支持 IL－21能增強(qiáng) NK細(xì)胞細(xì)胞毒效應(yīng)的結(jié)論［5～8］。傳統(tǒng)理論認(rèn)為NK細(xì)胞的活化是細(xì)胞表面活化型受體和抑制型受體綜合作用的結(jié)果，因此本實驗分別從基因和蛋白質(zhì)水平上檢測了rhIl－21對NK－92MI細(xì)胞表面主要活化型受體NKG2D的調(diào)節(jié)。結(jié)果表明，50ng/ml的rhIl－21能逐漸增強(qiáng)NKG2D基因mRNA的表達(dá)，并能顯著增強(qiáng)培養(yǎng)48h后NK－92MI細(xì)胞表面NKG2D受體的平均熒光強(qiáng)度。Skak等［8］報道IL－21能增強(qiáng)外周血單個核細(xì)胞中NK細(xì)胞表面細(xì)胞毒效應(yīng)受體NKp46、活化型受體NKG2D及抑制型受體CD94和NKG2A不同程度的表達(dá)上調(diào)，而最終表現(xiàn)為細(xì)胞毒活性的增強(qiáng)。而 Burgess等［6］曾報道IL－21通過下調(diào)純化人primary NK細(xì)胞表面NKG2D/DAP10的表達(dá)，而抑制primary NK細(xì)胞通過NKG2D和其配體介導(dǎo)的細(xì)胞毒活性。這種結(jié)果的差異是否由不同細(xì)胞系造成?有待于體內(nèi)實驗或更多實驗進(jìn)一步驗證。

RT－PCR結(jié)果顯示IFN－γ、穿孔素及顆粒酶的表達(dá)隨rhIL－21培養(yǎng)時間的延長而逐漸增強(qiáng)，且IFN－γ的分泌及顆粒酶蛋白表達(dá)水平也明顯增強(qiáng)。這進(jìn)一步驗證了NK－92MI被rhIL－21活化后細(xì)胞毒效應(yīng)的增強(qiáng)機(jī)制。IFN－γ是在細(xì)胞免疫中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子，顯然rhIL－21促進(jìn)NK－92MI細(xì)胞分泌的IFN－γ，進(jìn)一步增強(qiáng)了細(xì)胞免疫能力。這有利于在腫瘤免疫中機(jī)體抗腫瘤免疫的能力，但也可能導(dǎo)致機(jī)體過度免疫而產(chǎn)生自身免疫性疾病。當(dāng)然機(jī)體的免疫平衡的維持靠復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)。曾有研究表明高濃度的IFN－γ能下調(diào)人NK細(xì)胞活化型受體NKG2D基因及蛋白水平的表達(dá)，IL－21可以通過對轉(zhuǎn)錄因子Eomesodermin的抑制而下調(diào)CD4+T細(xì)胞分泌IFN－γ能力。

通過本實驗的研究，進(jìn)一步認(rèn)識了IL－21對人NK細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用，然而對單純的體外實驗和細(xì)胞系研究并不能模擬人體復(fù)雜的微環(huán)境，實驗結(jié)果不能完全揭示疾病狀態(tài)下IL－21對NK細(xì)胞的調(diào)節(jié)。因此通過對自身免疫性疾病或腫瘤患者機(jī)體免疫狀態(tài)的檢測、細(xì)胞因子的分析及精細(xì)的體內(nèi)實驗的研究，觀察IL－21在相關(guān)疾病中所扮演的角色，將對全面認(rèn)識IL－21生物學(xué)活性非常重要。

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6 Burgess SJ，Marusina A I，Pathmanathan I，etal.IL－21 down－regulates NKG2D/DAP10 expression on human NK and CD8+T cells［J］.J Immunol，2006，176(3):1490－1497

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