烏梅提取物對蠟狀芽孢桿菌的抑菌機(jī)理研究

劉夢茵，劉 芳，周 濤，諸永志，徐為民,*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014；2.南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院，江蘇 南京 210097)

烏梅提取物對蠟狀芽孢桿菌的抑菌機(jī)理研究

劉夢茵1,2，劉 芳1，周 濤2，諸永志1，徐為民1,*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014；2.南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院，江蘇 南京 210097)

研究烏梅提取物抑制蠟狀芽孢桿菌的抑菌機(jī)理。通過堿性磷酸酶含量的測定研究烏梅提取物對細(xì)胞壁完整性的影響；采用考馬斯亮藍(lán)法測胞外蛋白質(zhì)量濃度的變化；通過觀察電導(dǎo)率變化研究烏梅提取物對細(xì)胞膜通透性的影響；采用SDS-PAGE電泳法觀察烏梅提取物作用下菌體蛋白質(zhì)的變化。結(jié)果表明：烏梅提取物破壞細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加，進(jìn)而使細(xì)胞內(nèi)容物外泄；同時(shí)烏梅提取物對細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成有一定影響，阻礙細(xì)菌蛋白質(zhì)的正常表達(dá)。

烏梅；抑菌機(jī)理；蠟狀芽孢桿菌

烏梅為薔薇科植物梅(Prunus mume Sieb. et Zucc)的將成熟的果實(shí)青梅經(jīng)干燥而成，是一資源極為豐富, 應(yīng)用范圍極廣的傳統(tǒng)中藥[1]。蠟狀芽孢桿菌是一種好氧性、可以形成芽孢的革蘭氏陽性桿菌，分布廣泛[2-3]。已有研究者證明烏梅提取物具有很強(qiáng)的抑菌作用[4]。經(jīng)過前期實(shí)驗(yàn)，證實(shí)烏梅能夠抑制蠟狀芽孢桿菌的生長，本實(shí)驗(yàn)對烏梅提取物抑制蠟狀芽孢桿菌的機(jī)理進(jìn)行研究，為烏梅的開發(fā)和利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

堿性磷酸酶試劑盒 南京建成生物工程公司；N-(2-羥乙基)哌嗪-N, -2-乙烷磺酸(HEPES) 北京索萊寶科技有限公司。

UV-6100紫外分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；DDS-11A電導(dǎo)率儀 上海理達(dá)儀器廠。

1.2 菌種與培養(yǎng)基

蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus) 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所畜產(chǎn)品實(shí)驗(yàn)室。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯 北京陸橋公司。

1.3 菌懸液的制備

取對數(shù)生長期的菌液，于5000r/min離心10min，取其沉淀用pH7.0的2.5mmol/L HEPES緩沖液洗滌一次，重懸浮在HEPES緩沖液中，制備成OD650nm值為0.800± 0.02的菌懸液備用。

1.4 烏梅提取液的制備工藝流程

1.5 烏梅提取物對細(xì)胞壁完整性的影響

這個(gè)夜晚，我捧著一碗米湯，像是捧著一碗全世界最烈的酒。我把這最烈的酒獻(xiàn)給一棵樟，這個(gè)夜晚，我對著它說出了心底的秘密，希望能長出它一樣的勇氣。

分別將1倍和3倍最低抑菌質(zhì)量濃度(MIC)的烏梅提取物加入到菌懸液中，于37℃、150r/min搖床培養(yǎng)，以蒸餾水代替提取物作為對照組，定時(shí)取樣，3500r/min離心10min，取上清液用堿性磷酸酶試劑盒方法測定堿性磷酸酶(AKP)的含量，隨時(shí)間延長檢測AKP含量的變化情況。

1.6 烏梅提取物對細(xì)胞膜通透性的影響

分別將1倍MIC和3倍MIC的烏梅提取物加入到菌懸液中，于37℃、150r/min搖床培養(yǎng)，用蒸餾水代替提取物作為對照組，定時(shí)取樣，測定菌懸液的電導(dǎo)率值。

1.7 烏梅提取物對胞外蛋白的影響

取1.5節(jié)方法制備的上清液用考馬斯亮藍(lán)法[6]測定胞外蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。

1.8 細(xì)菌蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳分析

將培養(yǎng)至對數(shù)期的蠟狀芽孢桿菌加到含1倍MIC濃度烏梅提取物的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基含菌體107個(gè)/mL，以加蒸餾水的菌液為對照，于37℃、150r/min搖床培養(yǎng)，并于3、 6h和9h分別取樣6mL。各樣品均稀釋成相同的OD650nm值后離心取沉淀，在各樣品沉淀中分別加入50μL無菌水和200μL上樣緩沖液混勻，于100℃水浴中煮沸5min，再次離心取15μL上清液上樣進(jìn)行電泳。

2 結(jié)果與分析

圖1 胞外堿性磷酸酶含量的變化Fig.1 Effect of Fructus Mume extract on extracellular AKP content

堿性磷酸酶是存在于細(xì)胞壁與細(xì)胞膜之間的一種酶，正常情況下在胞外不能檢測到其活性。但當(dāng)細(xì)胞壁或細(xì)胞膜遭到破壞后，透性增加，其將泄漏到細(xì)胞外，通過檢測細(xì)胞外酶的變化可以反映細(xì)胞壁的透性變化[7-8]。從圖1可以看出，經(jīng)烏梅提取物作用后胞外堿性磷酸酶含量明顯增大，3倍MIC烏梅提取物處理的菌懸液堿性磷酸酶的含量高于1倍MIC烏梅提取物處理的樣品，差異顯著(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明烏梅提取物對蠟狀芽孢桿菌的細(xì)胞壁有一定破壞作用，造成細(xì)胞壁通透性的增加，破壞了細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性，導(dǎo)致了胞外堿性磷酸酶的增加，高質(zhì)量濃度的烏梅提取物對細(xì)胞壁的破壞力更強(qiáng)。

2.2 烏梅提取物對細(xì)胞膜通透性的影響

細(xì)胞膜是細(xì)菌的保護(hù)屏障，當(dāng)細(xì)菌遇到強(qiáng)抑菌劑而使細(xì)胞膜遭到破壞時(shí)，菌體的保護(hù)屏障被打破, 使其內(nèi)部電解質(zhì)外泄至培養(yǎng)液中，進(jìn)而使培養(yǎng)液的電導(dǎo)率上升，因此，菌液電導(dǎo)率的變化反映了細(xì)菌細(xì)胞膜通透性的變化[9]。

圖2 烏梅提取物對菌體處理不同時(shí)間的電導(dǎo)率變化Fig.2 Effect of Fructus Mume extract on electrical conductivity

由圖2可知，0h時(shí)添加烏梅提取物的菌懸液的電導(dǎo)率值高于對照組，可能是由于烏梅提取物自身的帶電荷成分使電導(dǎo)率值增大。隨著時(shí)間的延長，添加烏梅提取物的菌懸液電導(dǎo)率逐漸增大，且添加3倍MIC烏梅提取物的菌懸液的電導(dǎo)率增大趨勢更明顯，而對照組電導(dǎo)率值基本不變。因此推斷烏梅提取物破壞了細(xì)胞膜的完整性，使細(xì)胞膜通透性增加，細(xì)胞質(zhì)滲漏，電解質(zhì)不斷滲出，導(dǎo)致電導(dǎo)率的升高。

2.3 烏梅提取物對胞外蛋白質(zhì)量濃度的影響

圖3 烏梅提取物對胞外蛋白質(zhì)量濃度的影響Fig.3 Effect of Fructus Mume extract on extracellular protein content

由圖3可知，烏梅提取物作用后的菌懸液胞外蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度增大，3倍MIC的烏梅提取物處理的菌懸液胞外蛋白質(zhì)含量高于1倍MIC烏梅提取物處理的樣品。由于蛋白質(zhì)分子相對較大，因此當(dāng)細(xì)胞膜完整性受到破壞時(shí)蛋白質(zhì)大分子會(huì)大量泄漏到胞外。烏梅提取物的加入使蠟狀芽孢桿菌的細(xì)胞破裂，造成細(xì)胞質(zhì)外泄，因細(xì)胞質(zhì)中含有大量蛋白質(zhì)成分，從而引起胞外蛋白含量的提高。

2.4 細(xì)菌蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳分析

圖4 烏梅提取物作用下蠟狀芽孢桿菌蛋白質(zhì)的SDS-PAGE電泳Fig.4 SDS-PAGE of culture supernatants of Bacillus cereus after incubation in the presence of Fructus Mume extract

由圖4可知，隨著時(shí)間的延長細(xì)菌在培養(yǎng)基中生長，蛋白質(zhì)的譜帶逐漸增多并變清晰。與對照相比添加烏梅提取物的菌體蛋白電泳譜帶變淺或消失。3h時(shí)R2譜帶與對照相比變淺；6h時(shí)R1、R3、R4消失，R2變淺；9h時(shí)各譜帶均變淺。這說明烏梅提取物對菌體蛋白正常代謝有一定的抑制，使其蛋白總量表達(dá)水平呈下降趨勢。

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過對堿性磷酸酶含量、電導(dǎo)率和胞外蛋白質(zhì)量濃度的測定，發(fā)現(xiàn)烏梅提物物破壞了蠟狀芽孢桿菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致內(nèi)容物滲出。李小芳等[10]研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜是殼聚糖對金黃色葡萄球菌作用的位點(diǎn)，殼聚糖改變了細(xì)胞膜的滲透性而使細(xì)胞膜破壞，伴隨大量細(xì)胞內(nèi)容物泄露。張赟彬等[11]研究發(fā)現(xiàn)荷葉精油可造成大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌菌體細(xì)胞膜透性的變化，引起菌體內(nèi)含物的滲漏，從而造成液體培養(yǎng)基電導(dǎo)率和還原糖含量增加。錢麗紅[12]研究了茶多酚對金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的抑菌機(jī)理，結(jié)果表明茶多酚可破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)、導(dǎo)致細(xì)胞通透性增加，進(jìn)而使細(xì)胞內(nèi)容物外泄。韓誠武[13]研究發(fā)現(xiàn)副干酪乳桿菌影響了菌體細(xì)胞膜選擇通透性，引起質(zhì)子動(dòng)力勢的耗散，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。張緯等[14]研究檸檬提取物對耐藥金黃色葡萄球菌的抑菌作用，可能是通過破壞細(xì)菌細(xì)胞壁，改變細(xì)菌某些關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)或功能蛋白的合成來達(dá)到對細(xì)菌的抑制作用。另外，細(xì)菌蛋白質(zhì)SDSPAGE電泳分析結(jié)果表明烏梅提取物抑制了菌體蛋白的正常代謝。韓淑琴等[15]、王關(guān)林等[16]分別在研究仙人掌提取物和發(fā)根土壤桿菌K84所產(chǎn)細(xì)菌素的抑菌機(jī)理時(shí)發(fā)現(xiàn)，SDS-PAGE電泳時(shí)，抑菌物質(zhì)作用后的蛋白譜帶中蛋白條帶減少、顏色變淡，推斷是由于抑菌物質(zhì)阻礙了DNA對蛋白質(zhì)合成的表達(dá)或是蛋白質(zhì)正常合成過程受阻。錢麗紅[12]通過SDS-PAGE分析，證實(shí)茶多酚可以阻礙細(xì)菌蛋白質(zhì)的正常表達(dá)，以致影響其細(xì)胞的結(jié)構(gòu)組成以及酶的催化活性，最終導(dǎo)致細(xì)菌正常生理功能的喪失。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，烏梅提取物對蠟狀芽孢桿菌具有抑制和破壞作用，作用機(jī)理是烏梅提取物破壞了細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的完整性，增加了細(xì)胞膜的通透性，使細(xì)胞內(nèi)容物滲出，使電導(dǎo)率增大，胞外蛋白含量增加，造成菌體不可恢復(fù)性損傷，從而失去代謝和增殖活性；同時(shí)烏梅提取物干擾了菌體蛋白的正常表達(dá)。

[1]阮毅銘. 烏梅的化學(xué)成分及藥理作用概述[J]. 中國醫(yī)藥導(dǎo)刊, 2008, 10(5): 793-794.

[2]KRAMER J M, GILBERT R J. Bacillus cereus and other Bacillus species[M]// DOYLE M P. Food borne bacterial pathogens. New York: Marcel Dekker, Inc., 1989: 21-70.

[3]ANDERSSON, RONNER U, GRANUM P E. What problems does the food industry have with the spore-forming pathogens Bacillus cereus and Clostridium perfringens[J]. International Journal of Food Microbiology, 1995, 28(2): 145-155.

[4]許臘英, 余鵬, 毛維倫, 等. 中藥烏梅的研究進(jìn)展[J]. 湖北中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2003, 5(1): 52-56.

[5]鄭鈞鏞, 王光寶. 藥品微生物學(xué)及檢驗(yàn)技術(shù)[M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 1989.

[6]郭藹光, 郭澤坤. 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M]. 北京: 高等教育出版社, 2007.

[7]HARA S, YAMAKAWA M. A novel type of antibacterial peptide isolated from the silkworm, Bombyχ mori[J]. Journal of Biological Chemistry, 1995, 270(50): 29923-29927.

[8]黃秀琴, 王衛(wèi)星. 補(bǔ)體對大腸桿菌的致死過程[J]. 華東師范大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 1996(2): 103-105.

[9]馬迪根M T, 馬丁克J M. 微生物生物學(xué)[M]. 11版. 李明春, 楊文博,馬迪根M T, 譯. 北京: 科學(xué)出版社, 2009: 95-113.

[10]李小芳, 馮小強(qiáng), 楊聲, 等. 殼聚糖對金黃色葡萄球菌抑菌機(jī)理的研究[J]. 中國食品工業(yè), 2010(9): 81-83.

[11]張赟彬, 繆存鉛, 宋慶, 等. 荷葉精油對肉類食品中常見致病菌的抑菌機(jī)理[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(19): 63-66.

[12]錢麗紅. 茶多酚對金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的抑菌機(jī)理[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2010, 37(11): 1628-1633.

[13]韓誠武. 副干酪乳桿菌素抑菌活性及抑菌機(jī)理的研究[D]. 哈爾濱: 黑龍江大學(xué), 2008.

[14]張緯, 孫曉明, 徐建設(shè), 等. 檸檬提取物對耐藥金黃色葡萄球菌抑制作用機(jī)制的初步研究[J]. 中國病原生物學(xué)雜志, 2009, 4(9): 652-655.

[15]韓淑琴, 楊洋, 黃濤, 等. 仙人掌提取物的抑菌機(jī)理[J]. 食品科技, 2007 (3): 130-134.

[16]王關(guān)林, 姜丹, 方宏筠, 等. 高產(chǎn)細(xì)菌素菌株WJ K84-1的誘變篩選及其對植物病原菌抑菌機(jī)理的研究[J]. 微生物學(xué)報(bào), 2004, 44(1): 23-28.

Anti-Bacillus cereus Mechanisms of Fructus Mume Extract

LIU Meng-yin1,2，LIU Fang1，ZHOU Tao2，ZHU Yong-zhi1，XU Wei-min1,*
(1. Institute of Agricultural Products Processing, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China；2. Ginling College, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China)

The objective of the present study was to investigate the mechanisms for the inhibition of Bacillus cereus by Fructus Mume extract. The effect of Fructus Mume extract on the integrity of cell wall was studied by determining the content of alkaline phosphatase (AKP). The contents of extracellular proteins were assayed by Bradford method. Cell membrane permeability was examined based on changes in electrical conductivity. The effect of Fructus Mume extract on the synthesis of bacterial proteins was analyzed by SDS-PAGE. The results indicated that Fructus Mume extract could damage the structures of cell wall and cell membrane, causing an increase in cell membrane permeability and the release of intracellular contents. Fructus Mume extract could also affect the synthesis of bacterial proteins and block protein expression in bacteria.

Fructus Mume；nantibacterial mechanism；Bacillus cereus

TS202.3

A

1002-6630(2012)01-0103-03

2011-03-11

江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項(xiàng)目(CX(09)627；CX(10)230)；江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(BK2010469)

劉夢茵(1986—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锟萍?。E-mail：liumengyin19861201@163.com

*通信作者：徐為民(1969—)，男，研究員，博士，研究方向?yàn)槭称芳庸づc質(zhì)量控制。E-mail：weiminxu2002@yahoo.com.cn