牛初乳中富脯氨酸多肽的純化與鑒定

余 芳，李德龍，張 波，高艷玲，張少輝,2,*

( 1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240；2.上海交通大學(xué)陸伯勛食品安全中心，上海 200240)

牛初乳中富脯氨酸多肽的純化與鑒定

余 芳1，李德龍1，張 波1，高艷玲1，張少輝1,2,*

( 1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240；2.上海交通大學(xué)陸伯勛食品安全中心，上海 200240)

以牛初乳為原料，提取分離具有生物活性的富脯氨酸多肽(proline-rich polypeptides，PRP)，并從氨基酸組成、分子質(zhì)量大小和反相色譜方面對其進行測定和分析。結(jié)果表明：分離所得多肽脯氨酸含量高達20%；SDS-PAGE顯示主成分分子質(zhì)量分布范圍在5～25kD；反相色譜主要譜峰在乙腈體積分數(shù)37%～45%處洗脫，在這一體積分數(shù)范圍內(nèi)可得到純度高達96.7%的富脯氨酸多肽。

富脯氨酸多肽；分子質(zhì)量；氨基酸組成；反相色譜

哺乳動物產(chǎn)后2～3d內(nèi)所分泌的乳汁統(tǒng)稱為初乳[1]。牛初乳作為一種新型功能食品的開發(fā)來源，不僅含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，而且也富集了一些具有生物活性的免疫因子和生長因子，如免疫球蛋白、乳鐵蛋白、溶菌酶、類胰島素生長因子等。經(jīng)科學(xué)實驗證明這類物質(zhì)具有免疫調(diào)節(jié)、改善胃腸道、促進生長發(fā)育等一系列生理活性功能。因而牛初乳作為動物和人類的重要營養(yǎng)物質(zhì)，具有抵抗疾病的功能，可作為新一代功能性食品資源庫在保健食品行業(yè)中廣泛應(yīng)用[2-3]。

富脯氨酸多肽(proline-rich polypeptides，PRP)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種來源于牛初乳的多肽類活性成分。PRP的發(fā)現(xiàn)源于1974年，波蘭科學(xué)家Janusz等[4]在采用凝膠過濾法純化羊初乳IgG2時，伴隨IgG2同時存在著另一種成分，一種不能同時被抗免疫球蛋白的抗血清所沉淀的物質(zhì)PRP。之后的研究表明PRP具有特殊的結(jié)構(gòu)及特性：富含大量的脯氨酸和疏水性氨基酸；在4℃條件下可溶于水，室溫下發(fā)生可逆性沉淀；它可以調(diào)節(jié)人體的免疫反應(yīng)，增強皮膚脈管的滲透性[5]，是一種免疫活性物質(zhì)。近年來又發(fā)現(xiàn)這種成分對阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)具有很好的預(yù)防及治療作用[6-7]，因而將這種活性成分從牛初乳中分離出來，并對其某些物理化學(xué)性質(zhì)作客觀的鑒定評價，對今后生物活性功能的研究和牛初乳功能性食品的應(yīng)用都具有重要意義。

在歐美等發(fā)達國家，隨著人口老齡化的增加，AD的發(fā)病率有逐年增加的趨勢。由此，英美國家對于初乳來源的PRP功能的研究亦開始漸熱。他們研究的內(nèi)容主要針對PRP糜蛋白酶水解物某些片段的生物活性功能，尤其是在抗氧化、抗衰老、抗神經(jīng)退行性病變的功效，而對于天然狀態(tài)PRP的純化鑒定相對較少。在國內(nèi)更是未見PRP的相關(guān)報道。因此本研究借助有機溶劑提取、鹽析、透析等一系列蛋白質(zhì)純化的方法從初乳中分離出PRP，并通過分子質(zhì)量大小、氨基酸組成和反向色譜分析進行化學(xué)鑒定，以期更全面地了解這種活性物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛初乳為乳牛產(chǎn)后第1天的初乳，由蒙牛丹陽現(xiàn)代牧場饋贈。

SDS、溴酚藍、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺 國藥集團化學(xué)試劑公司；Tris、甘氨酸 美國Sigma公司；乙腈 美國Fisher公司；所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

A..KTA Purifier 10層析系統(tǒng)、Source 5RPC ST 4.6/150反相柱 美國GE Healthcare公司；GL-22M型高速冷凍離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司；L-8900型全自動氨基酸分析儀 日本Hitachi公司；Mini-PROTEAN Tetra System 美國Bio-Rad公司；0.22μm 超濾膜 美國Millipore公司；DYY-6C型電泳儀 北京市六一型儀器廠；透析袋MD34 英國Whatman公司；BS124s型電子分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；CM-230型摩爾超凈水機 上海摩勒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 PRP的提取

按兩步純化(乙醇提取，硫酸銨沉淀)法提取PRP[8-9]：室溫條件下解凍牛初乳，8000×g離心20min脫脂，在低溫條件下加入體積分數(shù)60%乙醇抽提，邊加入邊攪拌，酪蛋白等雜蛋白不斷析出，12000×g離心，取上層有機相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙醇，蒸發(fā)溫度設(shè)為30℃，待體積恢復(fù)至原脫脂乳體積之后，離心去除不溶性沉淀。取PRP水相，以50%飽和硫酸銨鹽析，沉淀PRP以少量超純水溶解，隔夜透析，透析液凍干后保存于-20℃?zhèn)溆?。以上所有步驟未特別標明的均在4℃條件下操作。

1.3.2 PRP分子質(zhì)量的檢測

根據(jù)表1制備分離膠及濃縮膠。樣品與2×樣品緩沖液以1:1體積混合稀釋后，沸水中加熱5min，室溫條件下冷卻，然后上樣進行電泳實驗。待指示劑距凝膠下沿0.2～0.5cm處停止電泳，染色30min后開始脫色。計算電泳遷移率(Rf)。

測定小分子多肽的電泳遷移率(Rf)，制作標準曲線并計算被測樣品的分子質(zhì)量：以Marker條帶的遷移率為橫坐標，以其對應(yīng)的分子質(zhì)量對數(shù)為縱坐標作圖，經(jīng)線性回歸計算，制作標準曲線。

1.3.3 PRP氨基酸組成分析

酸水解法水解上述純化后的PRP[10]：稱取2mg放入玻璃管中，加入2mL 6mol/L HCl，充氮氣5min，封管。將玻璃管放在110℃恒溫干燥箱內(nèi)水解24h。水解結(jié)束后冷卻至室溫，定容至10mL，過濾，取1mL濾液置真空干燥器中55℃左右抽真空干燥，加入純水 1mL溶解。加入0.1mmol/L NaOH，調(diào)節(jié)pH值至1.7～2.2，0.22μm濾膜過濾，轉(zhuǎn)入樣品瓶待測。用全自動氨基酸分析儀進行氨基酸組成的分析。

1.3.4 PRP的反相色譜分析

1.3.4.1 色譜工作條件

流動相A液：2% 乙腈水溶液(含0.02%三氟乙酸)；流動相B液：75%乙腈；流速1mL/min；進樣量1mL；紫外檢測波長228nm。流動相 A、B 液需超聲脫氣后使用。

1.3.4.2 反相色譜分析

稱取適量的PRP凍干粉，以少量0.01%二甲基亞砜(DMSO)助溶，加入A液調(diào)節(jié)質(zhì)量濃度，使質(zhì)量濃度在0.5～1mg/mL左右，0.22μm濾膜過濾后上樣。經(jīng)Source 5RPC ST 4.6/150反相層析柱進行線性梯度洗脫。

表1 SDS-PAGE電泳膠配方Table1 Recipe for SDS-PAGE gel

2 結(jié)果與分析

2.1 PRP的分子質(zhì)量

蛋白質(zhì)分子質(zhì)量測定常規(guī)的方法包括SDS-PAGE和凝膠色譜技術(shù)[11]。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)，在查看蛋白混合物樣品的復(fù)雜程度以及純化效果的同時，可以預(yù)估PRP的分子質(zhì)量。

圖1 PRP混合肽的SDS-PAGE電泳圖Fig.1 SDS-PAGE pattern of PRP

SDS-PAGE能夠較好地顯示標準蛋白條帶(圖1)。當?shù)鞍踪|(zhì)的分子質(zhì)量在15～200kD時，電泳遷移率與分子質(zhì)量的對數(shù)值呈直線關(guān)系，符合下列方程：

1gMr=K-bRf

式中：Mr為蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量；K為常數(shù)；b為斜率；Rf為相對遷移率。在條件一定時，b和K均為常數(shù)。

根據(jù)電泳結(jié)果，對分子質(zhì)量對數(shù)(y)和分離膠中的遷移率(χ)進行線性回歸分析，回歸方程為y＝-1.3276χ＋2.0909，相關(guān)系數(shù)R2＝0.9741，具有良好的線性關(guān)系。

PRP混合肽經(jīng)SDS-PAGE電泳，根據(jù)分子質(zhì)量的差異，不同的多肽成分被分開。PRP多肽片段的分子質(zhì)量分布在5～25kD范圍內(nèi)，且不同多肽之間豐度存在差異，較為清晰的有4個條帶。根據(jù)標準曲線計算，前2個條帶中對應(yīng)的分子質(zhì)量分別為24.52、19.47kD；分子質(zhì)量較小的多肽也有兩條且較為接近，分布在5～14.4kD之間，約為10kD。

2.2 PRP的氨基酸組成

本研究將透析之后的PRP分成兩部分：一部分為可溶性的PRP，另一部分在透析過程中析出，以沉淀形式存在的物質(zhì)。為了研究沉淀物質(zhì)是否屬于變性的PRP，本研究對這兩部分都進行了氨基酸組成的分析。

表2 PRP的氨基酸分析表Table2 Amino acid composition of PRP

由表2可知，沉淀與上清液部分谷氨酸、纈氨酸、亮氨酸、脯氨酸的量均明顯高于其他氨基酸，其中脯氨酸所占的比率分別為19.2%、20.5%。單純從氨基酸組成來看，上清液中谷氨酸、纈氨酸、脯氨酸均較沉淀有增加，視為PRP混合肽的特征氨基酸，說明沉淀中包含變性的PRR混合肽。另外，氨基酸分析結(jié)果顯示PRP中脯氨酸所占的比例約20%，疏水性氨基酸40%，酸性氨基酸21%。由于脯氨酸是一種環(huán)狀的亞氨基酸，是組成蛋白質(zhì)的常見20種氨基酸中唯一的亞氨基酸，在肽鏈中有特殊的作用，易于形成順式的肽鍵，不利于α螺旋的形成。有相關(guān)文獻報道，由于脯氨酸的引入導(dǎo)致多肽和蛋白高級結(jié)構(gòu)的變化，相應(yīng)地對應(yīng)著一定的生物學(xué)功能[12]。因此，PRP這種氨基酸組成提示PRP結(jié)構(gòu)與生物活性之間可能存在關(guān)系。

2.3 PRP的純化與反相色譜

采用反相色譜(RPC)方法，使用C18反相柱和梯度體積分數(shù)乙腈溶液對PRP進行了純化。

圖2 不同檢測波長下的PRP吸收峰Fig.2 Absorption spectra of PRP under different detection wavelengths

反相色譜分析結(jié)果顯示，在不同檢測波長下，PRP在228nm處信號較強，且基線漂移不顯著，選擇228nm作為檢測波長(圖2)。228nm檢測波長下，圖譜顯示提純的PRP各不同多肽之間疏水性的差異不明顯，50%～60% B液時PRP混合多肽可以洗脫下來，換算后即為37%～45%乙腈(圖3)。相關(guān)研究認為，這一體積分數(shù)洗脫出來的PRP多肽是Colostrinin的主成分，決定了產(chǎn)品的主要活性功能[13]。Unicorn軟件積分得到的洗脫峰的總面積為200.70，35～40min內(nèi)的目標峰面積為194.12，純度高達96.7%。

圖3 PRP反相色譜圖Fig.3 RP-HPLC profile of PRP

RPC與其他色譜方法相比具有分辨率和回收率高、重復(fù)性好、操作簡便等優(yōu)勢。本研究結(jié)果表明采用RPC方法，使用合適的反相柱和洗脫液能夠?qū)RP類低分子質(zhì)量蛋白進行有效的分離純化。相關(guān)文獻也表明與較大分子質(zhì)量蛋白質(zhì)的分離相比，RPC更適用于分子質(zhì)量小、空間折疊相對簡單的多肽。因為蛋白質(zhì)的立體構(gòu)型及構(gòu)象復(fù)雜，與流動相、固定相及樣品中的其他成分之間往往存在多種復(fù)雜的相互作用，使蛋白變性失活。但作為一種分析手段，卻能夠給出蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征及疏水性等信息[14]。

3 結(jié) 論

本研究借助有機溶劑提取、鹽析、透析等一系列蛋白質(zhì)純化的方法，從牛初乳中分離并純化了PRP混合性多肽，以分子質(zhì)量大小，氨基酸組成和反相色譜差異為指標鑒定了PRP混合多肽的物理化學(xué)特性。PRP不是單一肽，而是一種混合肽，組成較為復(fù)雜，SDS-PAGE顯示的分子質(zhì)量分布在5～25kD左右，豐度較高的多肽有4條，分子質(zhì)量較大的為24.52、19.47kD。PRP的氨基酸組成較為特殊，脯氨酸、谷氨酸、纈氨酸、亮氨酸的含量較高，其中脯氨酸約20%，疏水性氨基酸40%，酸性氨基酸21%。反相圖譜顯示PRP不同多肽之間結(jié)構(gòu)差異不明顯，采用C18反相柱和體積分數(shù)為37%～45%的乙腈洗脫可得到純度96.7%的PRP產(chǎn)物。

初乳功能性食品的開發(fā)研究具有廣闊的應(yīng)用前景。PRP作為初乳來源的功能性成分，沒有物種特異性，對包括人在內(nèi)的所有哺乳動物都能起作用，可以廣泛應(yīng)用在保健食品行業(yè)。目前，還不能達到逐個分離PRP單一多肽的要求，關(guān)于結(jié)構(gòu)特點的描述尚停留在混合物層面上。單一多肽的分離鑒定、相應(yīng)生物學(xué)功能的研究以及作用機制是未來研究的方向之一。

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Purification and Identification of Proline-rich Polypeptides from Bovine Colostrum

YU Fang1，LI De-long1，ZHANG Bo1，GAO Yan-ling1，ZHANG Shao-hui1,2,*
( 1. School of Agriculture and Biology, Shanghai JiaoTong University, Shanghai 200240, China；2. Luh Bor. S. Research Center for Food Safety, Shanghai JiaoTong University, Shanghai 200240, China)

Bovine colostrum was extracted to obtain bioactive proline-rich polypeptides (PRP). The molecular weight and amino acid composition of PRP were analyzed by means of SDS-PAGE and an automated amino acid analyzer, respectively. Reversedphase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) was employed to purify PRP. The results showed that the proline content in PRP was as high as 20%. The molecular weights of principal components were in the range of 5-25 kD as determined by SDS-PAGE. RP-HPLC showed that major spectral peaks were eluted by 37%-45% acetonitrile. As a result, PRP with a purity of 96.7% was obtained.

proline-rich polypeptide；molecular weight；amino acid composition；reversed-phase chromatography

TS252.1

A

1002-6630(2012)01-0077-04

2011-01-23

余芳(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為乳品科學(xué)。E-mail：yuflili@sjtu.edu.cn

*通信作者：張少輝(1965—)，男，研究員，博士，研究方向為乳品科學(xué)。E-mail：shaohuizhang@sjtu.edu.cn