ISSR和SRAP標(biāo)記技術(shù)在葫蘆科植物種質(zhì)資源研究中的應(yīng)用

蹇黎

（貴州畢節(jié)學(xué)院地理與生命科學(xué)院，551700）

葫蘆科（Cucurbitaceae）植物一般是常見雙子葉瓜類爬藤植物的總稱，是食用植物中最重要科之一，僅次于禾本科、豆科和茄科。中國具有豐富的栽培葫蘆科植物種質(zhì)資源，幾乎遍及全國各地，共有29余屬，142余種，占葫蘆科植物的1/4[1]。葫蘆科植物不僅具有食用價(jià)值，而且還具有很高的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。但由于葫蘆科植物具有特殊的生長環(huán)境和生活習(xí)性，如果只靠單一的常規(guī)育種手段對(duì)其進(jìn)行品種改良，可能會(huì)導(dǎo)致種質(zhì)資源的匱乏而致使資源的保護(hù)利用、研究與推廣受阻，從而不能滿足市場(chǎng)的需求，因此，解決這些問題必須借助于先進(jìn)的研究技術(shù)與方法。

分子標(biāo)記是繼形態(tài)學(xué)標(biāo)記、生物化學(xué)標(biāo)記以及細(xì)胞學(xué)標(biāo)記之后發(fā)展起來的一種直接反映遺傳物質(zhì)DNA水平多態(tài)性的遺傳標(biāo)記，具有基因組變異豐富、標(biāo)記數(shù)量多、目標(biāo)基因表達(dá)不受生物的發(fā)育階段及環(huán)境影響、檢測(cè)手段方便快捷、成本較低等特點(diǎn)，已成為資源系統(tǒng)鑒定與種質(zhì)資源育種研究最高效的手段之一。ISSR（Inter-simple sequence repeat，簡單重復(fù)序列間擴(kuò)增）和SRAP（相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性，Sequence-related amplified polymorphism）都是基于PCR標(biāo)記系統(tǒng)的一種新型的顯性分子標(biāo)記技術(shù)。ISSR是在微衛(wèi)星基礎(chǔ)上發(fā)展起來的[2]，結(jié)合了簡單重復(fù)序列（Single sequence repeat,SSR）標(biāo)記技術(shù)和隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性DNA（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，其引物不但能在種間通用，而且更能揭示物種間的多態(tài)性，其檢測(cè)手段非常方便快捷。SRAP綜合了RAPD和AFLP的高效、重復(fù)性好、便于目標(biāo)基因的克隆與測(cè)序等諸多優(yōu)點(diǎn)[3]。ISSR和SRAP標(biāo)記技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于葫蘆科植物種質(zhì)資源的親緣關(guān)系鑒定與遺傳多樣性分析、分子遺傳圖譜的構(gòu)建與目的性狀基因的標(biāo)記定位、基因庫的構(gòu)建和基因克隆以及育種輔助選擇與品種的純度鑒定等方面的研究。本文將從以上幾方面來綜述ISSR與SRAP分子標(biāo)記技術(shù)在葫蘆科植物種質(zhì)資源研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀，并對(duì)其資源更合理高效的保護(hù)和利用進(jìn)行探討。

1 ISSR與SRAP原理及特點(diǎn)

ISSR與SRAP分子標(biāo)記技術(shù)是檢測(cè)種質(zhì)資源間（內(nèi)）的基因片段差異性最高效、最理想的遺傳標(biāo)記方法。

1.1 ISSR分子標(biāo)記

ISSR分子標(biāo)記是在微衛(wèi)星基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種顯性遺傳標(biāo)記，結(jié)合了SSR和RAPD標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)，是在不用知道SSR兩端的堿基序列的基礎(chǔ)上添加2～4個(gè)隨機(jī)核苷酸。在PCR反應(yīng)過程中，此引物既保證了錨釘序列位點(diǎn)的退火溫度，也可以減少其他靶點(diǎn)的退火幾率，對(duì)基因組片段的差異進(jìn)行檢測(cè)，其擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過電泳分析進(jìn)行多態(tài)性分析。ISSR標(biāo)記技術(shù)具有其引物可在種間通用、穩(wěn)定性好、多態(tài)性高、無需知道SSR靶標(biāo)序列信息、重復(fù)性好、易操作、快捷方便、成本低等諸多優(yōu)點(diǎn)。不足之處在于不同引物及不同材料間PCR擴(kuò)增反應(yīng)最佳條件可能不盡相同，很難區(qū)分顯性純雜合基因型。目前，許多葫蘆科植物均建立和優(yōu)化了各自最適的ISSR-PCR反應(yīng)體系。

1.2 SRAP分子標(biāo)記

SRAP分子標(biāo)記是一種結(jié)合了RAPD、AFLP、RFLP等分子標(biāo)記優(yōu)點(diǎn)并克服其缺點(diǎn)的PCR標(biāo)記系統(tǒng)的顯性新型標(biāo)記，是通過獨(dú)特的雙引物（17 bp上游引物和18 bp下游引物）設(shè)計(jì)對(duì)啟動(dòng)子或內(nèi)含子區(qū)域進(jìn)行特異擴(kuò)增，其引物具有通用性。該標(biāo)記是建立在不同種質(zhì)資源的啟動(dòng)子、內(nèi)含子與間隔區(qū)長度的不同而致使其種間和種內(nèi)表現(xiàn)出明顯的多樣性。SRAP分子標(biāo)記具有多態(tài)性高、重復(fù)性好、易操作、快捷方便、成本低、在基因組中分布均勻、易對(duì)特定序列進(jìn)行測(cè)序與相關(guān)基因的克隆等諸多優(yōu)點(diǎn)。

2 ISSR與SRAP技術(shù)的應(yīng)用

ISSR與SRAP分子標(biāo)記技術(shù)與其他分子技術(shù)及傳統(tǒng)的常規(guī)遺傳標(biāo)記相比較而言，優(yōu)點(diǎn)更多，已在葫蘆科植物種質(zhì)資源的研究中廣泛應(yīng)用?，F(xiàn)將ISSR與SRAP分子標(biāo)記技術(shù)在葫蘆科植物中的應(yīng)用情況進(jìn)行綜述和探討。

2.1 遺傳多樣性研究

植物遺傳多樣性一般是指種間或種內(nèi)的不同個(gè)體的遺傳差異之和，是物種生存適應(yīng)與發(fā)展進(jìn)化的基本特征及物種長期進(jìn)化演變的產(chǎn)物。研究物種的遺傳多樣性可以了解與其生長環(huán)境之間的關(guān)系，采取科學(xué)高效的措施保護(hù)瀕危物種遺傳資源基因，認(rèn)識(shí)生物多樣性的起源與進(jìn)化，同時(shí)也根據(jù)資源的DNA指紋圖譜和各個(gè)目標(biāo)性狀間的多樣性，使其植物種質(zhì)資源更能合理高效的利用。高山等[4]采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)38份瓠瓜種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，12個(gè)ISSR引物共擴(kuò)增出96條多態(tài)性帶，平均每個(gè)引物擴(kuò)增的多態(tài)性帶數(shù)為8條，多態(tài)性比率平均為83.5%。劉萬勃等[5]利用ISSR標(biāo)記對(duì)甜瓜種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性研究，10個(gè)ISSR引物共擴(kuò)增出73條多態(tài)性帶紋，多態(tài)比率為65.51%。王佳等[6]利用ISSR對(duì)黃瓜種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，8個(gè)ISSR引物共擴(kuò)增出42條帶紋，其多態(tài)比率為85.71%。段會(huì)軍等[7]利用RAPD、ISSR和AFLP對(duì)西瓜枯萎病菌進(jìn)行遺傳多樣性評(píng)價(jià)，21個(gè)引物共擴(kuò)增出188條帶紋，其中多態(tài)性帶134條，多態(tài)比率為71%。康建坂等[8]運(yùn)用ISSR分子標(biāo)記對(duì)48個(gè)苦瓜樣品的遺傳多樣性進(jìn)行研究，14個(gè)ISSR引物共擴(kuò)增出181條帶紋，其中多態(tài)性譜帶為113條，多態(tài)性比率為60.32%。張愛萍等[9]采用SRAP技術(shù)對(duì)西瓜種質(zhì)資源的遺傳多樣性進(jìn)行研究，51個(gè)引物組合共產(chǎn)生431條擴(kuò)增帶，其中243條帶具有多態(tài)性，多態(tài)性比率為56.4%。陳蕓等[10]利用SRAP對(duì)甜瓜種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，16對(duì)SRAP引物組合擴(kuò)增出452個(gè)位點(diǎn)，其中265個(gè)為多態(tài)性位點(diǎn)，多態(tài)性比率為58.63%。劉軍等[11]利用12對(duì)SRAP引物組合對(duì)絲瓜種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，共擴(kuò)增出118條多態(tài)性帶紋。Sikdar等[12]利用同工酶、RAPD和ISSR標(biāo)記對(duì)葫蘆科植物遺傳多樣性分析，10種ISSR引物共擴(kuò)增出100條多態(tài)性帶紋。Heikal等[13]利用RAPD和ISSR技術(shù)對(duì)南瓜屬植物遺傳多樣性進(jìn)行分析，7種ISSR引物酶共擴(kuò)增出263條帶紋，其中多態(tài)帶紋為243條，多態(tài)性比率為92.4%。Ferriol等[14]利用SRAP和AFLP對(duì)西葫蘆進(jìn)行了遺傳多樣性分析。

2.2 親緣關(guān)系及系統(tǒng)分類研究

ISSR和SRAP分子標(biāo)記技術(shù)能有效地確定葫蘆科植物種質(zhì)資源間的親緣關(guān)系及品種間的遺傳距離，進(jìn)而可以劃分雜交種優(yōu)勢(shì)群，提高葫蘆科植物育種效率。Heikal等[13]利用RAPD和ISSR技術(shù)對(duì)南瓜屬植物的親緣關(guān)系進(jìn)行鑒定，C.moschata1、C.moschata2、C.pepo5、C.pepo7、C.pepo9 品種之間的親緣關(guān)系最近，而C.pepo1與C.pepo9、C.pepo 5與C.moschata5之間的遺傳相似系數(shù)最低，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，ISSR技術(shù)將112個(gè)南瓜屬植物劃分為兩大類群。鐘開勤[15]利用RAPD和ISSR技術(shù)對(duì)38份瓠瓜種質(zhì)資源進(jìn)行親緣關(guān)系分析，其遺傳相似系數(shù)分布在0.43～0.96，福州芋瓠05與漢龍碧玉02相似系數(shù)最大，為0.96，ISSR將38份材料分為5個(gè)類群8組，主坐標(biāo)分析將其分為4個(gè)類群10組。陳朝文[16]利用ISSR技術(shù)對(duì)絲瓜種質(zhì)資源進(jìn)行親緣關(guān)系分析，大部分地方絲瓜品種的遺傳相似系數(shù)為0.7以上，其中明春研三號(hào)絲瓜和純英早青肉絲瓜，早雜二號(hào)肉絲瓜和金美肉絲瓜，春研三號(hào)絲瓜和長沙肉絲瓜GS值都在0．93以上，親緣關(guān)系最近，此標(biāo)記技術(shù)將162份黃瓜種質(zhì)資源劃分為五大類群。汪偉裁[17]利用ISSR技術(shù)對(duì)苦瓜種質(zhì)資源進(jìn)行分析，武漢品種641和日本品種643相似系數(shù)達(dá)0.786，其親緣關(guān)系很近。高山等[18]利用ISSR技術(shù)對(duì)苦瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性進(jìn)行分析，將38份苦瓜種質(zhì)資源劃分為三大類群7組，劃分類群與形態(tài)上以顏色分類比較接近。

2.3 品種及種質(zhì)資源鑒定

ISSR標(biāo)記技術(shù)和SRAP技術(shù)能快速高效地對(duì)葫蘆科植物品種及種質(zhì)資源進(jìn)行鑒定。高山等利用ISSR技術(shù)對(duì)38份苦瓜種質(zhì)資源進(jìn)行分析，10個(gè)引物能擴(kuò)增多態(tài)性帶紋（200～2 000 bp），其中UCB 835擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性比率最高（66.67%），能將品種有效區(qū)分。羊杏平等[19]利用RAPD和ISSR標(biāo)記鑒定了西瓜雜交種的遺傳純度，62個(gè)ISSR引物中發(fā)現(xiàn)了2個(gè)能產(chǎn)生母本特異標(biāo)記條帶的引物（JAASIS27和JAASIS57），分別產(chǎn)生了母本特異標(biāo)記，檢測(cè)雜交種蘇蜜5號(hào)的遺傳純度。王吉明等[20]利用SRAP技術(shù)鑒定了甜瓜屬植物種間雜交及其雜交后代，1對(duì)SRAP引物（E14/M2）擴(kuò)增出少量父本（西印度瓜）特征帶，證明西印度瓜與V129甜瓜已經(jīng)在DNA分子水平上發(fā)生了交換。王從彥等[21]利用SRAP技術(shù)鑒定了西瓜種子純度，32對(duì)SRAP引物對(duì)5份西瓜雜交種純度分別為 94.91%，94.18%，94.91%，94.91%，94.64%。王惠哲等[22]應(yīng)用SRAP技術(shù)分析了28份黃瓜的遺傳差異，明確在不同的種間和種內(nèi)存在著一定程度的遺傳分化。

2.4 遺傳圖譜的構(gòu)建

通過構(gòu)建葫蘆科植物種質(zhì)資源的遺傳圖譜來顯示其特異基因或遺傳標(biāo)記的相對(duì)位置，為系統(tǒng)研究葫蘆科植物資源基因組和特異基因的定位克隆提供理論依據(jù)。徐晴等[23]利用39個(gè)SRAP標(biāo)記對(duì)黃瓜遠(yuǎn)緣群體進(jìn)行分子遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建和分析，該遺傳圖譜覆蓋基因組長度為743.11 cM，平均圖距4.67 cM，每個(gè)連鎖群上標(biāo)記數(shù)3～41個(gè)，長度8.02～140.16 cM，最大的連鎖群含有最多的41個(gè)標(biāo)記，覆蓋140.16 cM，平均間距3.42 cM，最小的連鎖群含有4個(gè)標(biāo)記，覆蓋8.02 cM；平均圖間距最大的是第7連鎖群，為8.32 cM，最小的是第9連鎖群，為2.01 cM。易克等[24]利用38個(gè)SSR和10個(gè)ISSR引物構(gòu)建西瓜遺傳圖譜，總長度為558.1 cM，平均圖距為11.9 cM，其中最大的連鎖群（s1）由24個(gè)標(biāo)記組成，總長度為 305.7 cM；3 個(gè)較小的連鎖群（s3，s5，s6）中，標(biāo)記數(shù)為 3～5 個(gè)，距離在 28.5～57.3 cM；其余均為2個(gè)標(biāo)記組成的連鎖群，11個(gè)連鎖群中有5個(gè)連鎖群（s3，s4，s7，s9，s10）。 張仁兵等[25]利用 13 個(gè) ISSR標(biāo)記用重組自交系構(gòu)建西瓜分子遺傳圖譜（15個(gè)連鎖群），包括1個(gè)最大的含31個(gè)標(biāo)記的連鎖群（277.5 cM）、6 個(gè)大的含 4～12 個(gè)標(biāo)記的連鎖群（51.7～172.2 cM）和8個(gè)小的含2～5個(gè)標(biāo)記的連鎖群（7.9～46.4 cM），覆蓋基因組的 1 027.5 cM；2 個(gè)標(biāo)記間的平均距離為11.54 cM。Yeoah等[26]利用SRAP和ISSR標(biāo)記構(gòu)建了黃瓜的遺傳圖譜，覆蓋基因組的992.2 cM。

3 結(jié)語

目前，雖然葫蘆科植物種質(zhì)資源的保護(hù)和育種技術(shù)在不斷的發(fā)展，新的葫蘆科植物品種也在不斷的育成，但這仍不能滿足國內(nèi)外蔬菜市場(chǎng)的需求。在葫蘆科植物種質(zhì)資源研究方面，隨著分子標(biāo)記技術(shù)的完善與發(fā)展，該技術(shù)能夠準(zhǔn)確地鑒定、評(píng)價(jià)和發(fā)掘葫蘆科植物種質(zhì)資源的優(yōu)異特異性狀基因；加快葫蘆科植物品種的培育、葫蘆科植物特異基因的克隆、資源的遺傳多樣性及親緣關(guān)系的鑒定；能夠高效合理地利用和創(chuàng)新優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源，改良其抗病、抗逆、延長成熟期等多種農(nóng)藝性狀來豐富葫蘆科植物種質(zhì)資源的遺傳基礎(chǔ)。綜上所述，ISSR和SRAP分子標(biāo)記技術(shù)均具有操作簡便、重復(fù)性強(qiáng)、引物通用、多態(tài)性好及成本低等諸多優(yōu)點(diǎn)，但只是應(yīng)用到部分葫蘆科植物種質(zhì)資源遺傳多樣性及親緣關(guān)系等方面的基礎(chǔ)研究。因此，只有將分子標(biāo)記技術(shù)融入到育種中才能培育出觀賞和食用藥用價(jià)值高的優(yōu)良新品種。

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