分子標(biāo)記鑒定葫蘆科瓜類作物種子純度的研究進(jìn)展

劉愛群，趙麗麗，王國政，趙越

（遼寧省農(nóng)科院蔬菜所，沈陽，110161）

種子在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有極其重要的地位，是最基本的生產(chǎn)資料，其質(zhì)量直接關(guān)系到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的安全和優(yōu)良品種增產(chǎn)潛力的發(fā)揮。種子的純度是指品種典型一致性的程度，是衡量種子質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，是進(jìn)行種子分級的主要依據(jù)，是保證優(yōu)良品種增產(chǎn)潛力得以發(fā)揮的關(guān)鍵因素，也是種子品質(zhì)控制中最棘手的問題。因此，開展種子純度檢測對保證種子品質(zhì)和提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)效益具有重要意義。

目前應(yīng)用于瓜類作物比較多的種子純度檢測方法有種子形態(tài)檢測、田間種植檢測、同工酶檢測、DNA分子標(biāo)記檢測。不同品種種子形態(tài)差異很大，田間種植檢測周期長，而且易受環(huán)境影響；同工酶法是檢測不同品種基因表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)之間的差異，多態(tài)性不夠豐富，并且受到組織和器官特異性的影響，使取材受到限制，從而較難推廣應(yīng)用[1]；DNA分子標(biāo)記反映了DNA水平上的生物個體間的遺傳差異，穩(wěn)定性高，不受組織類別、發(fā)育階段和環(huán)境條件的影響，技術(shù)操作簡單、快速，并且在特定條件下可長期保存等，為種子純度鑒定提供了一個全新的途徑。葫蘆科瓜類作物在蔬菜和水果生產(chǎn)中占有重要地位，但較番茄、水稻等作物，其分子標(biāo)記技術(shù)的研究還很薄弱[2，3]。本文擬就國內(nèi)外瓜類蔬菜作物分子標(biāo)記技術(shù)檢測種子純度的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為育種工作提供理論指導(dǎo)。

1 RFLP技術(shù)與種子檢測

限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）是發(fā)展最早的一種分子標(biāo)記技術(shù)。其基本原理是檢測DNA片段的大小，該片段是在限制性內(nèi)切酶酶切后所形成的特定的片段。同一品種個體間或不同品種間由于DNA核苷酸缺失、倒位、異位、重排等變異事件的發(fā)生，不同來源的限制性內(nèi)切酶酶切位點分布不同，不同個體產(chǎn)生的DNA片段大小也不同。該標(biāo)記穩(wěn)定性強、多態(tài)性高、結(jié)果準(zhǔn)確，不受植物生長發(fā)育階段的影響，可以在室內(nèi)進(jìn)行。但是，也存在一些不足，如操作繁瑣、檢測周期長、成本費用高、多態(tài)性檢出率低、探針特異性較強、DNA某些特定區(qū)域很難找到相應(yīng)的RFLP標(biāo)記等，這些不足限制了該技術(shù)在實踐中的應(yīng)用。

Matsuura等[4]運用RFLP探針酶組合對黃瓜親本及其F1雜交種進(jìn)行分析，確定可將其運用于種子純度鑒定。Neuhausen[5]對甜瓜種的遺傳多樣性進(jìn)行研究，利用RFLP技術(shù)在分子水平上對44份材料進(jìn)行分類，發(fā)現(xiàn)兩個類型分別為muskmelon和honeydew內(nèi)的多態(tài)性分子標(biāo)記比較少。

2 RAPD技術(shù)與種子檢測

隨機引物擴增多態(tài)性（RAPD）是Williams等[6]于1990年提出的，它以一個含10個堿基序列的核苷酸作引物，以生物基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴增，用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA序列的多態(tài)性來鑒別不同的品種。其多態(tài)性通常是某單一位點擴增產(chǎn)物的有無記錄，每種引物擴增的一條譜帶代表了被擴增基因組中的一個遺傳位點。RAPD技術(shù)對DNA需要量極少，且質(zhì)量要求不高，操作簡單，沒有放射性物質(zhì)，靈敏度強，分辨率高，成本較低，一套引物可以進(jìn)行不同生物基因組的分析，可以檢測整個基因組。該技術(shù)在作物遺傳育種中廣為利用。但RAPD標(biāo)記結(jié)果穩(wěn)定性欠佳，并且表現(xiàn)為顯性遺傳，不能區(qū)分顯性純合和雜合基因型，在推廣應(yīng)用上有一定局限性。

孫敏等[7]利用RAPD指紋圖譜對黃瓜種子純度進(jìn)行鑒定，并建立了適用于黃瓜早青2號父本、母本以及雜交種的純度鑒定方法。孫妮等[8]對苦瓜雜種一代及其父母本的特異性進(jìn)行分析，采用RAPD技術(shù)，結(jié)果引物OPU19擴增的 OPU19-1600 bp片斷在父本和F1中出現(xiàn)，在母本中未出現(xiàn)；對該一代雜種的 F2、Bl、B2代進(jìn)行的遺傳分析表明，OPU19-1600 bp片斷可能與父本的某一對基因連鎖，在F2、B1、B2代中符合孟德爾一對顯性基因的分離規(guī)律，從而證實其可用于區(qū)分母本與雜交種。劉富中等[9]利用PCR程序優(yōu)化，從80個隨機引物中篩選出5個可進(jìn)行3個甜瓜雜交種的純度鑒定的引物，并且發(fā)現(xiàn)其中一條引物可同時鑒定3個甜瓜雜交種，同時建立了快速進(jìn)行甜瓜RAPD分析的技術(shù)體系。李成偉等[10]利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)在節(jié)瓜種子純度鑒定上也取得了一定進(jìn)展。陳金體等[11]利用分子標(biāo)記技術(shù)對11個甜瓜品種進(jìn)行品種區(qū)別和種子純度鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用優(yōu)化的RAPD-PCR條件以及利用5個引物可以將11個甜瓜品種區(qū)別開來，并且還利用1個引物對銀輝甜瓜的雜交種子純度進(jìn)行了鑒定。而Truska等[12]在分析了3個黃瓜親本材料的RAPD多態(tài)性后發(fā)現(xiàn)黃瓜多態(tài)性差，認(rèn)為RAPD分析不適于驗證黃瓜雜交種的純度。

3 SSR技術(shù)與種子檢測

簡單序列重復(fù)（SSR）又稱微衛(wèi)星DNA[13]，是指以少數(shù)幾個核苷酸為單位多次串聯(lián)重復(fù)的DNA序列，如（GA）n、（AC）n、（GAA）n、（GATA）n等，廣泛分布于基因組的不同位置。由于基本單元重復(fù)次數(shù)不同，而形成了SSR的多態(tài)性。SSR的多態(tài)性所依賴的基本單元重復(fù)次數(shù)的變異在生物群體中大量存在，具有高度的變異性和豐富的多態(tài)性，具有RFLP的遺傳學(xué)優(yōu)點，比RAPD重復(fù)性和可信度高，且技術(shù)操作簡便，是目前遺傳標(biāo)記的熱點。但是由于SSR技術(shù)需要對所研究物種的基因位點進(jìn)行克隆和測序分析，設(shè)計相應(yīng)的引物，需要足夠的時間、人力和物力。一旦找到了多態(tài)性較高的引物，就可表現(xiàn)出SSR的優(yōu)越性。

張紅等[14]以2個甜瓜品種及其親本為試材，建立并優(yōu)化了單粒種子DNA快速提取法和RAPD、SSR分子標(biāo)記雜交種純度鑒定體系，研究發(fā)現(xiàn)，同RAPD相比，SSR分子標(biāo)記更適合甜瓜雜交種純度的快速鑒定。艾呈祥等[15]也開展了利用SSR分子標(biāo)記鑒定西瓜雜交種純度的研究，取得了可喜的進(jìn)展，篩選出雜交種鑒定的引物，有些可以直接用于田間置信度檢測。

李菊芬等[16]以西瓜雜交種東方紅1號和8424及其各自親本為材料，分別利用RAPD、ISSR和SSR 3種分子標(biāo)記技術(shù)對西瓜雜交種的多態(tài)性進(jìn)行了分析。研究發(fā)現(xiàn)，RAPD和ISSR引物中，均未篩選到能區(qū)分雜交種和其親本的特異引物；而從供試的SSR引物中篩選到3對特異引物，均可有效地對雜交種東方紅1號和8424的純度進(jìn)行快速鑒定，且結(jié)果與田間鑒定結(jié)果一致。張穎等[17]利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，建立了黃瓜品種室內(nèi)分子標(biāo)記遺傳純度鑒定與田間純度鑒定結(jié)果的回歸關(guān)系，得到了田間純度的預(yù)測方程式，由此可利用室內(nèi)遺傳純度鑒定的結(jié)果進(jìn)行田間純度的預(yù)測。

4 ISSR技術(shù)與種子檢測

簡單序列重復(fù)間區(qū)（ISSR）DNA標(biāo)記技術(shù)是Zietkiewicz等[18]在1994年提出的。ISSR技術(shù)的基本原理為設(shè)計出PCR引物，與真核生物基因組中存在的SSR序列相結(jié)合，對兩個距離較近、方向相反的DNA進(jìn)行擴增，最后檢測其序列的多態(tài)性。大多數(shù)ISSR標(biāo)記所用的PCR引物是基于動植物基因組中存在的大量雙核苷酸重復(fù)序列。其產(chǎn)物的多態(tài)性遠(yuǎn)比RFLP、RAPD、SSR豐富，能夠提供更多關(guān)于基因組的信息，而且穩(wěn)定性比RAPD好，試驗重復(fù)性好，符合孟德爾遺傳規(guī)律，具顯性或共顯性特點[19，20]，并且基因定位速度快，操作簡便，引物開發(fā)費用低。ISSR標(biāo)記在很多分子育種領(lǐng)域得到了應(yīng)用，有很大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

劉萬勃等[21]將ISSR和RAPD 2種分子標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，對甜瓜種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性的研究，首先根據(jù)2種標(biāo)記的結(jié)果，將供試材料分為兩類∶野生甜瓜和栽培甜瓜。兩種分子標(biāo)記的分析結(jié)果呈極顯著正相關(guān)（r=0.62＞r0.01）。各野生甜瓜種質(zhì)之間的遺傳距離較大，這與其分類地位基本一致。易克等[22]也利用SSR和ISSR標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建了西瓜的分子遺傳連鎖圖譜。朱巖芳等[23]對ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在植物種質(zhì)資源研究中的應(yīng)用進(jìn)行了綜述。Behera等[24]用29個RAPD和15個ISSR引物對38份印度苦瓜進(jìn)行遺傳多樣性聚類分析，結(jié)果表明，RAPD和ISSR的多態(tài)性評估是一致的，并且苦瓜栽培品種和野生材料的起源不同，因此這項研究可以為苦瓜種內(nèi)遺傳分析和育種選擇提供依據(jù)。羊杏平等[25]利用RAPD和ISSR 2種分子標(biāo)記對西瓜雜交種抗病蘇蜜和蘇蜜5號進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)了能用于純度檢測的RAPD父本、母本特異性引物和ISSR母本特異性引物，并且在ISSR標(biāo)記分析中很難找到父母本共顯性及父本特異標(biāo)記，得出單純用ISSR標(biāo)記鑒定2個F1雜交種純度是無效的結(jié)論。

5 AFLP技術(shù)與種子檢測

擴增片段長度多態(tài)性 （AFLP）是RAPD和RFLP兩種技術(shù)的結(jié)合，由Zabeau等[26]發(fā)明的一項專利技術(shù)。它將限制性酶切與PCR相結(jié)合，因此具有RFLP的可靠性和PCR技術(shù)的高效性，能夠在一個反應(yīng)內(nèi)檢測大量的限制性片段，為大量不同來源和不同復(fù)雜程度的基因組的分析提供便利，非常適合于遺傳圖譜的構(gòu)建、種質(zhì)資源分析、基因組定位與基因標(biāo)記等[27～29]。但該技術(shù)對DNA的純度和內(nèi)切酶的質(zhì)量要求很高，技術(shù)操作步驟多、時間長，加之受到專利保護(hù)，因此，應(yīng)用受到一定的限制。

翟文強等[30]利用AFLP技術(shù)對哈密瓜3個F1與其相應(yīng)的親本進(jìn)行分析，檢測其雜交種子的純度，研究發(fā)現(xiàn)可以通過指紋分析雜交種與其父、母本之間的遺傳關(guān)系，確定可以作為雜交種純度鑒定的依據(jù)。王玲平等[31]研究發(fā)現(xiàn)，以瓠瓜雜種一代浙蒲2號及其父、母本和品系J099為材料，運用AFLP對瓠瓜雜種進(jìn)行純度鑒定，同時建立了相關(guān)的技術(shù)體系，并且從引物組合中篩選出比較好的引物，該引物可以快速鑒定浙蒲2號種子純度。

6 SRAP技術(shù)與種子檢測

相關(guān)序列擴增多態(tài)性（SRAP）又叫基于序列擴增多態(tài)性，由Li等[32]在2001年提出，是一種新型分子標(biāo)記技術(shù)，它基于PCR技術(shù)，利用基因外顯子里G、C含量豐富，啟動子和內(nèi)含子里A、T含量豐富的特點設(shè)計兩套引物，并且對開放閱讀框架進(jìn)行擴增。此技術(shù)綜合了AFLP、RAPD、SSR等標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)點，如共顯性、穩(wěn)定、操作簡單、重復(fù)性強、中等產(chǎn)率等，能夠廣泛應(yīng)用于不同蔬菜作物的基因克隆、定位，以及遺傳圖譜的構(gòu)建等[33～35]。

李嚴(yán)[36]以西瓜雜交種及其親本為材料，利用25對SRAP引物對其種子進(jìn)行純度鑒定，研究發(fā)現(xiàn)擴增結(jié)果與田間種植純度鑒定結(jié)果十分接近，表明SRAP技術(shù)具有檢驗雜交種純度的能力。王從彥等[37]采用SRAP方法，利用引物ME 3/EM7，ME 7/EM 1對西瓜HR雜交種種子純度進(jìn)行鑒定，研究發(fā)現(xiàn)，SRAP純度鑒定結(jié)果與田間種植鑒定結(jié)果的相似率和相關(guān)性均較好，由此得出可用SRAP標(biāo)記鑒定法替代田間種植鑒定法。

7 EST-SSR技術(shù)與種子檢測

EST-SSR是指基于EST序列或者位于EST序列上開發(fā)的SSR標(biāo)記，也被稱為eSSR標(biāo)記；另外，有人利用cDNA克隆來開發(fā)研究SSR標(biāo)記，所獲得的標(biāo)記被稱為cSSR標(biāo)記，而傳統(tǒng)的利用基因組DNA開發(fā)的基因組SSR標(biāo)記則被稱為gSSR標(biāo)記。將SSR按照其來源分為廣義上的兩類，即ESTSSR（代表來自于轉(zhuǎn)錄區(qū)的SSR）和gSSR（代表來自于基因組上非轉(zhuǎn)錄區(qū)的SSR）。EST可用于新基因的發(fā)現(xiàn)、基因的表達(dá)、調(diào)控研究和基因芯片的底物等[38]。此外在種質(zhì)資源的研究中也有相關(guān)的報道[39，40]。

由于這項技術(shù)是近些年剛發(fā)展起來的，因此相關(guān)的研究報道甚少。盧銳等[41]利用102對EST-SSR引物對黃瓜雜交種哈研808及其親本進(jìn)行純度分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中有2對EST-SSR引物能夠用于黃瓜雜交種子純度的鑒定。

8 SCAR技術(shù)與種子檢測

序列特征化的擴增區(qū)域（SCAR）是由 Paran等[42]提出來的，是先將一個比較理想的RAPD標(biāo)記克隆、測序，然后設(shè)計出較長的引物，將引物合成后對不同材料中RAPD標(biāo)記的有無進(jìn)行擴增，從而檢測DNA間的差異。該方法快捷、方便、可靠，能夠快速檢測大量個體。SCAR標(biāo)記為顯性，穩(wěn)定性比RAPD高，但是技術(shù)步驟多、操作周期長、所需費用較高。

許勇等[43]獲得了西瓜與抗枯萎病基因相連鎖的SCAR標(biāo)記，該標(biāo)記已經(jīng)應(yīng)用于抗病轉(zhuǎn)育F3代群體中。這是2000年國內(nèi)外首次在西瓜上獲得抗病基因RAPD標(biāo)記和SCAR標(biāo)記，以及成功地將分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)用于西瓜抗枯萎病育種。王玲平等[44]也利用SCAR分子標(biāo)記發(fā)現(xiàn)了瓠瓜品系J083白粉病抗性基因。

9 問題與展望

分子標(biāo)記技術(shù)以其多態(tài)性高、遺傳穩(wěn)定、不受環(huán)境條件限制等優(yōu)勢被廣泛應(yīng)用于蔬菜作物種子純度鑒定。若雙親之一具有某一性狀則可應(yīng)用于F1種子純度鑒定，共顯性則為雜種，否則為假雜種。分子標(biāo)記技術(shù)的出現(xiàn)和不斷完善，勢必為葫蘆科瓜類作物遺傳育種提供更多的選擇空間。今后種子檢測應(yīng)注意以下幾個方面。

①采用分子標(biāo)記鑒定葫蘆科瓜類作物種子純度的研究起步比較晚，關(guān)于這方面的報道還比較少，另外，此類作物基因組比較少，遺傳基礎(chǔ)狹窄，變異幅度小，篩選出多態(tài)性差異的特異引物具有一定的難度。

②不同的分子標(biāo)記技術(shù)具有不同的優(yōu)缺點，在實際操作中，要根據(jù)研究對象和研究目的，善于利用標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)點，最好選擇2種以上分子標(biāo)記方法進(jìn)行檢測，并結(jié)合傳統(tǒng)的鑒定方法，這樣可使檢測結(jié)果更真實可靠。

③有些標(biāo)記技術(shù)尚處于研究階段，還需要進(jìn)一步研究和完善。同時注意那些操作簡便、穩(wěn)定性好、成本低廉、安全高效的分子標(biāo)記技術(shù)的開發(fā)、引入和創(chuàng)新。

④提高分子標(biāo)記技術(shù)鑒定種子純度的工作效率，實現(xiàn)半自動化或者全自動化操作，但是很多儀器和設(shè)備都比較昂貴，尚存在改進(jìn)之處。

⑤分子標(biāo)記技術(shù)需要根據(jù)不同蔬菜類型和不同作物品種類型采用不同的鑒定方法，因此必須建立完善的蔬菜作物種子純度鑒定體系，為種子純度室內(nèi)準(zhǔn)確檢測提供依據(jù)，從而加快蔬菜產(chǎn)業(yè)的良好發(fā)展。

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