發(fā)酵藕帶中優(yōu)良乳酸菌的篩選及生理性能研究

舒麗平，王清章，嚴(yán)守雷，李潔

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，武漢，430070）

藕帶（Lotus sprout），學(xué)名蓮鞭，又叫藕鞭、藕梁、藕樁子等，是荷的地下莖，橫生于泥中，并不斷分枝蔓延。藕帶一般是在野生蓮藕或子蓮出芽后抽取，以防止地下部分過密（類似疏葉）而影響上部生長從而影響蓮籽產(chǎn)量。藕帶是生長在淤泥中的天然綠色蔬菜，也是春夏餐桌上的美味佳肴。新鮮藕帶脆性較好、風(fēng)味佳、營養(yǎng)豐富，但在貯藏中極易褐變和變軟，產(chǎn)品外觀、營養(yǎng)價值和風(fēng)味品質(zhì)變差[1]。

泡菜是一種傳統(tǒng)的乳酸發(fā)酵蔬菜制品，可作為保健食品出售，經(jīng)常食用可調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡、降低膽固醇、提高機(jī)體免疫力。蔬菜泡制又是一種古老的冷加工及保藏方法，對蔬菜的營養(yǎng)成分、色、香、味、體的保持都極為有利。

發(fā)酵蔬菜的主要菌群——乳酸菌一直是人們研究的熱點(diǎn)。乳酸菌的發(fā)酵性能對縮短發(fā)酵時間、降低亞硝酸鹽含量、提高泡菜品質(zhì)和延長泡菜食用期等方面都有重要影響。一般接種發(fā)酵所使用的乳酸菌菌種都是從優(yōu)良的泡菜發(fā)酵體系中分離得到的，因?yàn)閷⒊Ｓ玫乃崮痰犬a(chǎn)品的專用菌接種于泡菜，可能存在適應(yīng)性差，生長繁殖困難，生產(chǎn)出的產(chǎn)品無發(fā)酵泡菜獨(dú)有的味道等問題。選擇適宜的菌種作發(fā)酵劑是得到優(yōu)良發(fā)酵制品的先決條件。因此，根據(jù)自身特點(diǎn)研究特定條件下菌種的發(fā)酵速度、產(chǎn)酸量、對不同發(fā)酵環(huán)境的適應(yīng)能力以及評價其最終的口感與風(fēng)味對優(yōu)良菌種的篩選以及確保純接種快速發(fā)酵技術(shù)的成功至關(guān)重要。

本試驗(yàn)主要從自然泡制藕帶中分離篩選出發(fā)酵產(chǎn)酸快、降解亞硝酸鹽能力強(qiáng)、風(fēng)味好的乳酸菌，并對其進(jìn)行鑒定和其發(fā)酵性能進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

①試驗(yàn)材料 泡菜原料（藕帶）、泡菜壇、食鹽，均市購。

②主要試劑和儀器設(shè)備 MRS肉湯培養(yǎng)基；多價蛋白胨-酵母膏（PY）培養(yǎng)基；氯化鈉；瓊脂；無水乙醇；無水氯化鈣；冰醋酸；鹽酸；亞硝酸鈉；對氨基苯磺酸；鹽酸萘乙二胺；氫氧化鈉；氫氧化鉀；葡萄糖；D-果糖；蔗糖；麥芽糖；乳糖等。

DSX-280型不銹鋼手提式滅菌器；SW-CJ-1FD型超凈工作臺；DNP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱；722可見分光光度計；Leica DME顯微鏡；Panasonic彩色閉路監(jiān)控攝像機(jī)等。

1.2 試驗(yàn)方法

①乳酸菌的分離、純化和初步鑒定篩選 藕帶發(fā)酵工藝流程如下∶藕帶→清洗、切分護(hù)色[2]→漂洗瀝干→5%食鹽水入壇泡制→水封、自然發(fā)酵。每隔2～3 d用無菌吸管和消毒器具在無菌操作下取樣，測定泡菜汁的pH值、藕帶的總酸和亞硝酸鹽含量。當(dāng)酸度達(dá)到 0.40%～0.80%或 pH 值 3.20～3.60 時，判斷其發(fā)酵成熟[3]?？偹岷堪?GB/T 12456-90測定；亞硝酸鹽含量按 GB/T 5009.33-2010測定。

在無菌操作下，對成熟泡菜汁進(jìn)行梯度稀釋，選取適宜的稀釋度，用混合法倒平板，于自制厭氧裝置中，30℃恒溫培養(yǎng)2 d后，選一定稀釋度的可計數(shù)平板，挑取可疑典型特征菌落，進(jìn)行2～3次劃線純化至單菌落，單菌落經(jīng)革蘭氏染色鏡檢、過氧化氫酶反應(yīng)，篩選出G＋，過氧化氫酶試驗(yàn)陰性的菌株；進(jìn)一步進(jìn)行產(chǎn)乳酸定性測定，將乳酸紙層析陽性菌株接種MRS 斜面，4℃下保存?zhèn)溆肹3，4]。

乳酸菌檢驗(yàn)按 GB/T 4789.35-2008操作；產(chǎn)乳酸定性試驗(yàn)采用乳酸紙層析法[5～8]；測 Rf（比移值）∶將待測菌株的Rf值與標(biāo)準(zhǔn)乳酸的Rf值進(jìn)行比較，Rf=原點(diǎn)到層析點(diǎn)中心的距離/原點(diǎn)到溶劑前沿的距離。

②乳酸菌的篩選[6，9]分別以產(chǎn)酸速度、亞硝酸鹽降解率、發(fā)酵藕帶風(fēng)味為指標(biāo)對分離的乳酸菌菌株進(jìn)行篩選。a.產(chǎn)酸速度。取經(jīng)活化的菌液以1%的接種量接種于10 mL MRS液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)48 h，每隔12 h測定1次pH 值。

b.亞硝酸鹽降解率。以無菌水代替NaNO2溶液為空白，將產(chǎn)酸速度快的活化菌液以1%的接種量接種到裝有1 mL 1 000 μg/mL NaNO2溶液和 9 mL液體培養(yǎng)基的試管中，另以1 mL NaNO2溶液和9 mL液體培養(yǎng)基的試管為對照，30℃培養(yǎng)72 h。過濾菌體，測定培養(yǎng)基中殘存的亞硝酸鹽含量。

c.接種發(fā)酵藕帶風(fēng)味試驗(yàn)。接種發(fā)酵工藝路線為∶

然后對成熟泡菜進(jìn)行感官評分[9，10]，感官品嘗小組由3～6人組成。

③篩選菌株的鑒定 a.形態(tài)學(xué)鑒定。觀察篩選菌株在平板上的菌落特征形態(tài)；對菌株進(jìn)行涂片革蘭氏染色，油鏡下觀察菌體形態(tài)。

b.生化特征鑒定。對篩選的優(yōu)良菌株分別進(jìn)行16種碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)酸、過氧化氫酶、硝酸鹽還原、淀粉水解、明膠液化、V-P試驗(yàn)、硫化氫產(chǎn)生、氨基酸脫羧及精氨酸產(chǎn)氨等試驗(yàn)[11，12，15～18]。

④菌株生理性能研究[6，9，13]a.生長曲線的測定。將活化后的菌液按10%的比例分別接種到12支MRS液體試管中，30℃培養(yǎng)，每隔2 h取出一支，在600 nm處測定培養(yǎng)液的吸光值（OD值），以相同條件下的空白培養(yǎng)基為對照。

b.菌株最適生長pH值測定。用乳酸或乳酸鈉將MRS液體培養(yǎng)基調(diào)至pH 值 1.6、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、9.0的不同pH值梯度系列，將培養(yǎng)到對數(shù)生長期的菌液以1%的接種量接種于其中，30℃培養(yǎng)48 h后測定其吸光值，以相同條件下的空白培養(yǎng)基作對照。

c.菌株鹽濃度適應(yīng)性試驗(yàn)。用NaCl將MRS液體培養(yǎng)基調(diào)至0%、2%、4%、6%、8%、10%的不同鹽濃度梯度系列，把培養(yǎng)到對數(shù)生長期的菌液以1%的接種量接種于其中，30℃培養(yǎng)48 h后測定其吸光值，以相同條件下的空白培養(yǎng)基作對照。

d.菌株最適生長溫度測定。把培養(yǎng)到對數(shù)生長期的菌液以1%的接種量接入MRS液體管中，分別在4、15、20、30、37、45℃培養(yǎng)，以同溫下不接種的空白培養(yǎng)基作對照，48 h后測定其吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離、純化和初步鑒定篩選

從成熟泡菜汁中初步分離純化得到22株具有可疑典型特征菌落的菌株。單菌落經(jīng)革蘭氏染色鏡檢、接觸酶反應(yīng)，篩選出9株均為G＋，接觸酶陰性的菌株，編號為 L1～L9。

在層析濾紙上，底版呈藍(lán)色而有機(jī)酸呈黃色斑點(diǎn)。被測9株菌株斑點(diǎn)的Rf值與標(biāo)準(zhǔn)乳酸斑點(diǎn)的Rf值比較，相對誤差都小于 1%（表1），可判斷為乳酸[5，8]。

2.2 乳酸菌的篩選

通過發(fā)酵產(chǎn)酸和降解亞硝酸鹽試驗(yàn)以及發(fā)酵藕帶感官評定，依次對L1～L9進(jìn)行篩選。

①發(fā)酵產(chǎn)酸速度 根據(jù)9株菌株產(chǎn)酸結(jié)果，篩選出 L1、L2、L3、L5、L6、L8、L9共 7 株產(chǎn)酸速度較快的菌株，在36～48 h內(nèi)，使培養(yǎng)液的pH值均降到3.60以下，適合純種發(fā)酵泡菜，發(fā)酵前期（24 h）產(chǎn)酸較快，后期由于高酸的抑制作用發(fā)酵速度減慢[14]。L4和L7產(chǎn)酸較慢，48 h后pH值均大于3.60。

②降解亞硝酸鹽能力 從7株產(chǎn)酸速度較快的乳酸菌菌株中得到5株亞硝酸鹽降解能力較強(qiáng)的菌 株 L1、L3、L6、L8、L9，其亞硝酸鹽降解率分別為73.73% 、89.65% 、97.40% 、91.78% 、79.69%，其余兩株菌對亞硝酸鹽降解能力較小。

表1 乳酸定性試驗(yàn)結(jié)果（發(fā)酵液的Rf值）

③接種發(fā)酵藕帶感官評價 將5株亞硝酸鹽降解能力強(qiáng)的菌株對接種藕帶發(fā)酵，篩選出發(fā)酵風(fēng)味好的優(yōu)良菌株。

本試驗(yàn)中泡菜制作過程未添加任何佐料，風(fēng)味來源僅為原料本身具有和發(fā)酵劑作用產(chǎn)生。對成熟泡菜進(jìn)行感官評分見表2，最終篩選出L3和L6兩株優(yōu)良菌株。這兩菌株純種發(fā)酵藕帶時，接近自然發(fā)酵的總體口味。

表2 藕帶泡菜感官評定結(jié)果（平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差）

圖1 L3（左）和 L6（右）菌株的光學(xué)顯微鏡觀察（×1 000）

2.3 篩選菌株的鑒定

篩選出的L3和L6菌株經(jīng)形態(tài)特征鑒定（圖1），可初步確定為乳酸菌。對L3和L6進(jìn)行碳水化合物發(fā)酵試驗(yàn)（表3）和生化試驗(yàn)（表4），并對照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》，判定L3為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum簡寫為 LP），L6為短乳桿菌（Lactobacillus brevis簡寫為Lb），均來自成熟藕帶泡菜汁，是發(fā)酵中后期的主導(dǎo)菌。

表3 兩株菌株的碳水化合物發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果

2.4 菌株生理性能研究

①菌株的生長曲線 由圖2可以看出，兩株菌的生長周期較短，起始生長速度快，培養(yǎng)4 h后就進(jìn)入對數(shù)生長期，12～16 h后即進(jìn)入穩(wěn)定期，以后生長趨于平緩。

②菌株生長的最適pH值 由圖3可以看出，菌株生長的最適pH值均為 5.0～6.0。相對來說，短乳桿菌有較強(qiáng)的耐酸性，在pH值3.0的環(huán)境中仍可生長良好，而植物乳桿菌生長很慢，兩株菌株對堿的耐受能力都較差，短乳桿菌在 pH值大于8.0時生長受到抑制，而植物乳桿菌耐堿能力較強(qiáng)，pH值大于9.0仍能一定程度存活。

③菌株的耐鹽性 圖4顯示，兩菌株對鹽均有較好的耐受能力，在含鹽量6%時仍能正常生長。隨著鹽濃度的升高，生長受到抑制，且植物乳桿菌較短乳桿菌耐鹽能力強(qiáng)，能在8%的鹽濃度中生長，而后者生長緩慢，但鹽濃度大于10%以后，兩株菌均基本不生長。

表4 兩株菌株的生化試驗(yàn)結(jié)果

圖2 菌株的生長曲線

圖3 不同pH值下菌株的生長情況

圖4 鹽濃度對菌株生長的影響

圖5 不同培養(yǎng)溫度下菌株的生長情況

④菌株生長的最適溫度 由圖5可知，兩菌株的生長溫度范圍（20～37℃）較寬，且生長良好，最適生長溫度均為30℃左右，它們在15℃時也能緩慢生長。

3 結(jié)論

①從自然泡制藕帶水中分離篩選出兩株發(fā)酵藕帶產(chǎn)酸能力強(qiáng)、亞硝酸鹽含量低、風(fēng)味好的乳酸菌菌株，生理生化鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plan-tarum）和短乳桿菌（Lactobacillus brevis）。

②兩株菌株最適生長 pH 值范圍均在 5.0～6.0，短乳桿菌在pH值3.0時生長良好，pH值大于8.0時生長受到抑制，植物乳桿菌在pH值3.0時生長很慢，而pH值大于9.0時仍能一定程度存活；在鹽濃度低于6%時兩菌株均能正常生長，10%含鹽量抑制其生長，植物乳桿菌能耐8%的鹽濃度；兩株菌株生長溫度范圍較寬（20～37℃），最適生長溫度均為 30℃，在15℃時也能緩慢生長。在MRS液體培養(yǎng)基中，兩株菌株對初始濃度為100 μg/mL的亞硝酸鹽的降解率分別為 89.65%和 97.40%。

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