Bcl-2基因家族與重癥肌無(wú)力

袁正洲 綜述，李作孝 審校

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川瀘州 646000)

重癥肌無(wú)力(myasthenia gravis,MG)是一種主要由乙酰膽堿受體抗體(acetylcholine receptor antibody,AchRab)介導(dǎo)的CD4+T細(xì)胞依賴(lài)的自身免疫性疾病。病變部位位于神經(jīng)-肌肉的突觸后膜，該膜上煙堿乙酰膽堿受體(nAchR)受到攻擊后數(shù)量減少，導(dǎo)致神經(jīng)肌肉接頭遞質(zhì)傳遞障礙[1]。細(xì)胞凋亡(apoptosis)又稱(chēng)之為細(xì)胞程序化死亡(programmed cell death)，是指在特定內(nèi)源和外源信號(hào)誘導(dǎo)下，細(xì)胞內(nèi)死亡程序激活而致的細(xì)胞主動(dòng)自殺，也是增殖的淋巴細(xì)胞被清除的主要方式[2]。細(xì)胞凋亡的發(fā)生、發(fā)展受到多種凋亡相關(guān)基因調(diào)控。引起MG免疫應(yīng)答的具體始動(dòng)環(huán)節(jié)目前還不是很清楚，但有研究表明淋巴細(xì)胞凋亡基因調(diào)節(jié)失控與MG的發(fā)生及發(fā)展關(guān)系緊密[3]。Bcl-2是調(diào)控淋巴細(xì)胞凋亡的重要家族，該家族成員眾多，不同成員對(duì)凋亡作用亦有差異。本文對(duì)Bcl-2基因家族與MG淋巴細(xì)胞凋亡的關(guān)系進(jìn)行綜述。

1 Bcl-2基因家族的組成及功能

1.1Bcl-2基因家族的組成 Bcl-2基因定位于18號(hào)染色體(18q21)，包括2個(gè)內(nèi)含子及3個(gè)外顯子，其第1個(gè)外顯子無(wú)翻譯功能，第2個(gè)內(nèi)含子具有非翻譯區(qū)。第2、3個(gè)外顯子具備編碼的功能，Bcl-2基因產(chǎn)物通過(guò)這兩個(gè)外顯子編碼[4]。Bcl-2基因家族可分為3個(gè)亞家族：(1)Bcl-2亞家族：抗細(xì)胞凋亡，成員有Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1、Al和Diva等；(2)Bax亞家族：促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，如Bak、Bcl-xS、Bax及Bok等；(3)BH3-only(Bcl-2 homology 3 only)蛋白亞家族：具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的功能，成員包括Bik、Bad、Bid、Bim、Hrk、Puma、Noxa等[5-6]。

1.2Bcl-2基因家族的結(jié)構(gòu)及功能 Bcl-2家族蛋白的主要結(jié)構(gòu)由2大結(jié)構(gòu)域構(gòu)建：(1)位于羧基端的跨膜結(jié)構(gòu)域；(2)數(shù)量不等(1～4個(gè))的BH。BH-3結(jié)構(gòu)域與促進(jìn)細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)，在促進(jìn)細(xì)胞凋亡進(jìn)程中扮演著至關(guān)重要的角色，被視為死亡結(jié)構(gòu)域[7]。BH-4結(jié)構(gòu)域作為抗凋亡蛋白所特有的一種結(jié)構(gòu)域，在其缺失的情況下，可使抗凋亡蛋白出現(xiàn)功能活性的喪失。螺旋結(jié)構(gòu)BH1-4結(jié)構(gòu)域出現(xiàn)在大多數(shù)的抗凋亡蛋白亞家族結(jié)構(gòu)域中。BH-3結(jié)構(gòu)域則為促凋亡蛋白亞家族結(jié)構(gòu)所共享，但促凋亡蛋白亞家族缺少a螺旋片段BH-4結(jié)構(gòu)域，而B(niǎo)H3-only蛋白亞家族結(jié)構(gòu)中僅含有BH-3結(jié)構(gòu)域。大部分成員都有跨膜結(jié)構(gòu)域(transmembrane domain,TM)，這有助于它們固定在如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體等胞內(nèi)細(xì)胞器膜上。

Bcl-2家族蛋白的相對(duì)濃度調(diào)控細(xì)胞凋亡線粒體通路，在其調(diào)控下，蛋白質(zhì)由線粒體膜間隙轉(zhuǎn)移到胞質(zhì)中[8]。Bcl-2家族的促凋亡蛋白Bak及Bax作用于線粒體，通過(guò)在其外膜孔釋放細(xì)胞色素c激活細(xì)胞的凋亡程序。Bak和Bax的聚合物(二聚體或多聚體)形成細(xì)胞色素c通過(guò)的孔洞，而抗凋亡蛋白Bcl-2與Bcl-xL通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性地與Bak和Bax結(jié)合而阻止細(xì)胞色素c漏出，影響胱冬酶3(caspase-3)的激活，從而抑制細(xì)胞凋亡[9]。

Bcl-2的表達(dá)在淋巴細(xì)胞成熟及建立正常免疫系統(tǒng)過(guò)程中呈階段性的變化。在胸腺組織的T淋巴細(xì)胞進(jìn)行陽(yáng)性選擇過(guò)程中Bcl-2表達(dá)出現(xiàn)下降趨勢(shì)，從而誘導(dǎo)CD4+CD8+雙陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)入凋亡途徑，而CD4+及CD8+單陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞中的Bcl-2水平卻表現(xiàn)為上升趨勢(shì)，這使T淋巴細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)育成熟,進(jìn)而建立起穩(wěn)定的正常免疫系統(tǒng)[10]。Bcl-2可結(jié)合與細(xì)胞凋亡有關(guān)的R-rasp23、Raf-1等信號(hào)傳導(dǎo)分子，通過(guò)影響分子信號(hào)的傳導(dǎo)通路而抑制細(xì)胞凋亡[11]。

2 Bcl-2基因家族在MG發(fā)病中的作用

2.1胸腺組織中Bcl-2基因家族表達(dá)與MG發(fā)病的關(guān)系 65%以上MG患者胸腺增生，病理改變?yōu)榱馨蜕l(fā)中心增生，其中心有B淋巴細(xì)胞存在。10%MG并發(fā)胸腺瘤，病理改變?yōu)榱馨图?xì)胞增生，大部分為T(mén)淋巴細(xì)胞。通過(guò)原位雜交技術(shù)對(duì)MG伴胸腺增生患者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)正常胸腺組織中的Bcl-2主要表達(dá)在髓質(zhì)和少量皮質(zhì)中，生發(fā)中心只有很少的Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞，上皮組織中則不表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞。在MG合并胸腺瘤患者中，Bcl-2的蛋白和mRNA在上皮組織中出現(xiàn)表達(dá)，同時(shí)髓質(zhì)中Bcl-2表達(dá)高于對(duì)照組。該實(shí)驗(yàn)同時(shí)表明Bax的蛋白和mRNA在正常胸腺組織中表達(dá)主要在髓質(zhì)、少量在皮質(zhì)。而在MG胸腺中，Bax蛋白和mRNA表達(dá)主要在上皮、少量在髓質(zhì)，且生發(fā)中心高表達(dá)Bax產(chǎn)物，Bax陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量與MG的Osserman分型呈正相關(guān)。這意味著B(niǎo)cl-2基因表達(dá)的上調(diào)可導(dǎo)致胸腺上皮細(xì)胞具備抗凋亡能力，最終致使MG發(fā)生進(jìn)展，而B(niǎo)ax在生發(fā)中心高表達(dá)則提示高凋亡指數(shù)[12]。

Kondo和Yoshino[13]用TUNEL法對(duì)MG患者的胸腺生發(fā)中心檢測(cè)原位DNA片段，發(fā)現(xiàn)MG發(fā)病可能是因?yàn)锽cl-2的上調(diào)，導(dǎo)致自身反應(yīng)性B淋巴細(xì)胞逃脫陰性選擇，產(chǎn)生了過(guò)量的AchRab從而引發(fā)自身性免疫反應(yīng)。另有研究[14]報(bào)道稱(chēng)MG患者的胸腺中Bcl-2基因表達(dá)增加，抑制了正常免疫細(xì)胞的凋亡發(fā)生。其免疫細(xì)胞成熟過(guò)程中因自身反應(yīng)性胸腺細(xì)胞受損，異?？寺〖?xì)胞產(chǎn)生免疫耐受紊亂，使淋巴細(xì)胞增殖異常而致B淋巴細(xì)胞持續(xù)分泌AchRab。由此可見(jiàn)，Bcl-2基因表達(dá)增加可抑制MG患者淋巴細(xì)胞的正常凋亡過(guò)程，這可能是導(dǎo)致MG患者自身免疫疾病發(fā)生的機(jī)制之一。

Bax與Bcl-2的比例決定了細(xì)胞凋亡的易感性。通過(guò)對(duì)經(jīng)過(guò)胸腺切除術(shù)治療的MG患者進(jìn)行研究，Salakou等[15]發(fā)現(xiàn)MG患者胸腺中的Bcl-2水平明顯高于陰性對(duì)照組，陽(yáng)性胸腺組織重量顯著比陰性胸腺增加。Bcl-2基因下調(diào)可破壞胸腺細(xì)胞的分化更新，長(zhǎng)期存活的細(xì)胞大量累積，從而導(dǎo)致MG胸腺腫瘤的發(fā)生。Bax的mRNA及蛋白質(zhì)促進(jìn)MG淋巴細(xì)胞凋亡，Bax與Bcl-2的比例可上調(diào)caspase-3從而激活和調(diào)節(jié)與MG進(jìn)展相關(guān)的細(xì)胞凋亡。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在Bax/Bcl-2比值小于1的情況下，即使沒(méi)有進(jìn)行藥物治療，也可出現(xiàn)病情改善甚至完全緩解的情況，這個(gè)比值可能是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因素。

2.2外周血Bcl-2基因家族表達(dá)與MG發(fā)病的關(guān)系 在MG患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中，Bcl-2的mRNA表達(dá)較對(duì)照組明顯高于對(duì)照組，且CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞亞群及CD19+細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)也明顯升高，同時(shí)CD3+T細(xì)胞蛋白表達(dá)Bcl-2的平均熒光強(qiáng)度亦升高[16]。PBMC中Bcl-2的mRNA相對(duì)表達(dá)量與MG患者病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，極重型、重型及中型患者PBMC中Bcl-2的mRNA表達(dá)水平要明顯高于輕型患者[17]。

MG患者PBMC中Bcl-2高表達(dá)，而B(niǎo)ad、Bax表達(dá)水平低[18]。CD4+T淋巴細(xì)胞的凋亡程度顯著低于空白對(duì)照組，而CD8+T淋巴細(xì)胞的凋亡程度介于二者之間，說(shuō)明MG患者PBMC中T淋巴細(xì)胞凋亡存在障礙，且凋亡障礙以CD4+T淋巴細(xì)胞為主。這導(dǎo)致清除活化的自身反應(yīng)性T細(xì)胞不及時(shí)，T輔助細(xì)胞的功能相對(duì)亢進(jìn)，B細(xì)胞在活化的T細(xì)胞作用下增殖活躍，進(jìn)而導(dǎo)致免疫應(yīng)答過(guò)強(qiáng)，產(chǎn)生眾多針對(duì)自身免疫系統(tǒng)的抗體，從而致使MG的發(fā)生[19]。

MG患者的PBMC的CD4+T淋巴細(xì)胞凋亡程度因不同臨床類(lèi)型及預(yù)后而高低明顯不同。與空白對(duì)照組相比，MG患者組中PBMC的CD8+T淋巴細(xì)胞所占比例顯著下降，CD4+T與CD8+T的比值明顯增高，而CD4+T細(xì)胞所占比例無(wú)顯著差異。這表明MG患者的T淋巴細(xì)胞亞群分布存在異常，抑制性T淋巴細(xì)胞的數(shù)量顯著降低，導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞的抑制能力下降，B淋巴細(xì)胞在T細(xì)胞亞群異常分布的調(diào)節(jié)下失控[20]。Bcl-2基因在胸腺T淋巴細(xì)胞進(jìn)行陽(yáng)性選擇時(shí)表達(dá)下降，調(diào)節(jié)CD4+CD8+雙陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞進(jìn)入正常的凋亡程序，而CD4+及CD8+單陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞的Bcl-2表達(dá)則上調(diào)使之進(jìn)一步發(fā)育，由此構(gòu)建正常的免疫體系。MG患者中胸腺T淋巴細(xì)胞進(jìn)行陽(yáng)性選擇時(shí)，Bcl-2基因表達(dá)顯著下降，從而促使CD4+CD8+雙陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞進(jìn)入異常的細(xì)胞凋亡程序[21]。

Bcl-2表達(dá)異常致使免疫細(xì)胞的凋亡失控，因而引起MG患者細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能紊亂。應(yīng)用糖皮質(zhì)激素治療后，MG患者血清里面Bcl-2的mRNA水平表現(xiàn)為明顯的降低且其水平與病情嚴(yán)重程度相關(guān)，這表明Bcl-2的mRNA水平可作為反映MG治療的效果的一個(gè)指標(biāo)[22]。Delfino等[23]的研究表明，表達(dá)Bcl-2的PBMC在培養(yǎng)過(guò)程中不但能夠長(zhǎng)期生存，還可以持續(xù)產(chǎn)生反應(yīng)程度劇烈的抗原，而這種抗原反應(yīng)產(chǎn)生的變化是活化的T淋巴細(xì)胞凋亡被強(qiáng)力抑制的結(jié)果，且與Bcl-2基因家族中抗凋亡亞族的表達(dá)呈正相關(guān)。

3 展 望

Bcl-2基因家族作為調(diào)控淋巴細(xì)胞凋亡的重要因子，在MG的早期診斷、判斷預(yù)后及治療中發(fā)揮重要作用。目前，國(guó)內(nèi)外治療MG大多是通過(guò)胸腺切除術(shù)、膽堿酯酶抑制劑、腎上腺皮質(zhì)激素及免疫抑制劑等方法[24]，但其長(zhǎng)期全身廣泛性的免疫抑制會(huì)產(chǎn)生諸多的不良反應(yīng)。應(yīng)用基因工程表達(dá)凋亡基因細(xì)胞的外蛋白，能有效消除自身免疫[25]。隨著B(niǎo)cl-2基因家族作用機(jī)制逐步明確，通過(guò)糾正其對(duì)淋巴細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)失控，從而改善乃至完全緩解MG的病情，可成為治療MG新的研究方向。以Bcl-2基因家族作為靶點(diǎn)研發(fā)新的治療藥物和設(shè)計(jì)新的治療方案，對(duì)MG的臨床治療具有潛在重大價(jià)值。

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