維生素D生物學(xué)效價(jià)研究的一些新進(jìn)展

石文標(biāo) 謝 明 侯水生黃 葦 喻俊英

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

對于生物學(xué)效價(jià)，即生物學(xué)利用率(bioavailability)，Ammerman 等［1］將其定義為動(dòng)物食入營養(yǎng)素中能被小腸吸收并參與代謝過程或貯存在動(dòng)物組織中的部分占食入總量的比值。維生素D是一種必須經(jīng)過代謝轉(zhuǎn)變才能達(dá)到最佳鈣化醇生物活性的脂溶性類固醇衍生物。皮膚合成的維生素D3或小腸吸收的維生素D由維生素D轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(vitamin D binding protein，DBP)運(yùn)輸，需在肝臟25－羥化酶(CYP2R1)和腎臟1α－羥化酶(CYP27B1)的催化下經(jīng)2次酶促羥化反應(yīng)形成最終的活性代謝產(chǎn)物 1，25－二羥基維生素D3［1，25-(OH)2D3］，與維生素 D 受體(vitamin D receptor，VDR)結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)功能。由此可以看出，維生素D的生物學(xué)效價(jià)受合成、吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、催化等過程的影響。近年來，隨著對維生素D在內(nèi)分泌、自分泌/旁分泌、免疫調(diào)節(jié)及信號傳導(dǎo)等功能上的深入研究，其越來越多地作為一種具有激素功能的物質(zhì)被重新認(rèn)識［2］。因此，從這一新的視角出發(fā)探究維生素D及其類似物的生理機(jī)制及生物學(xué)效價(jià)，對于傳統(tǒng)維生素D研究的進(jìn)一步發(fā)展是十分必要的。

1 維生素D生物學(xué)效價(jià)的評定方法

1.1 生物學(xué)方法

生物學(xué)方法包括“線譜鑒定”技術(shù)、外翻腸囊技術(shù)和動(dòng)物活體試驗(yàn)?！熬€譜鑒定”技術(shù)是通過給患有嚴(yán)重佝僂病的模型動(dòng)物飼喂維生素D飼糧一段時(shí)間后，對脛骨近端的鈣化程度進(jìn)行目測評分。此方法很耗時(shí)，并且誤差達(dá)到30%。外翻腸囊技術(shù)一般是通過給維生素D缺乏的動(dòng)物飼喂1次維生素D，待24 h后測量其腸道內(nèi)鈣轉(zhuǎn)運(yùn)速率和骨質(zhì)動(dòng)員速率的變化情況，以此評定維生素D的生物學(xué)效價(jià)。動(dòng)物活體試驗(yàn)是在一定的飼養(yǎng)期內(nèi)，用不同形式的維生素D(通常以維生素D2或維生素D3作為標(biāo)準(zhǔn)物)補(bǔ)飼相同摩爾水平的膽鈣化醇活性基團(tuán)到試驗(yàn)飼糧中飼喂試驗(yàn)動(dòng)物。試驗(yàn)結(jié)束后對試驗(yàn)動(dòng)物的多項(xiàng)敏感生理指標(biāo)進(jìn)行測定，然后用多元線性回歸求斜率比等方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析整理，計(jì)算出不同形式維生素D間的相對生物學(xué)效價(jià)。這種方法簡單易行，比較靈敏、準(zhǔn)確、客觀，但試驗(yàn)要求設(shè)定一定的濃度梯度，需使用較多的試驗(yàn)動(dòng)物，并且所測得的結(jié)果只是相對利用率。由于該方法在使用時(shí)動(dòng)物處于自然生長狀態(tài)，其試驗(yàn)結(jié)果對生產(chǎn)實(shí)際具有指導(dǎo)意義，可作為其他研究方法的參照基準(zhǔn)。

1.2 化學(xué)方法

化學(xué)方法的實(shí)質(zhì)是將堿性皂化過程中維生素D的前體物質(zhì)含量列為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，通過高效液相色譜、競爭結(jié)合試驗(yàn)及放射受體分析等一些現(xiàn)代生化分析方法測定每一種維生素D代謝物或類似物的生物學(xué)活性，從而達(dá)到精確量化維生素D的目的?；瘜W(xué)方法的誤差是7% ～8%，但因其需要經(jīng)過堿性水解、液－液萃取和固相萃取樣品清理等繁瑣步驟［3－4］，故此方法也相當(dāng)費(fèi)時(shí)。由于近10年來對25－羥基維生素D3［25-(OH)D3］生物學(xué)效價(jià)的研究越來越多，因此這種新的方法成為估測維生素D生物學(xué)效價(jià)的首選。

2 不同形式維生素D的生物學(xué)效價(jià)比較

從最初的維生素D3到25-(OH)D3再到最終代謝產(chǎn)物1，25-(OH)2D3，其生物學(xué)活性是成倍遞增的。對大多數(shù)哺乳動(dòng)物來說，維生素D3和維生素D2發(fā)揮著同樣的生物學(xué)效應(yīng)，但在禽類上維生素D3的生物學(xué)效價(jià)是維生素D2的10～30倍。Armas等［5］研究認(rèn)為，維生素D2維持人血清25－羥基維生素D［25-(OH)D］水平的效力只有維生素D3的30% ～50%。這與Biancuzzo等［6］的研究結(jié)果并不一致，他們認(rèn)為維生素D3和維生素D2的生物學(xué)效價(jià)不相上下，這可能與他們所用維生素D制劑的載體不同有關(guān)。Winter等［7］在體內(nèi)和體外的研究試驗(yàn)表明，在促進(jìn)腸道鈣轉(zhuǎn)運(yùn)上維生素D3與25-(OH)D3的生物學(xué)效價(jià)基本一致。歸納以往的研究結(jié)果［8－10］，維生素D3及其代謝產(chǎn)物的生物學(xué)效價(jià)對比大體上為維生素D3≤24，25－二羥基維生素 D3［24，25-(OH)2D3］=25，26 － 二羥 基 維 生 素 D3［25，26-(OH)2D3］≤25-(OH)D3≤1，25-(OH)2D3。

3 維生素D生物學(xué)效價(jià)的影響因素

3.1 影響維生素D生物學(xué)效價(jià)的內(nèi)在因素

3.1.1 活性維生素D的結(jié)構(gòu)與DBP及VDR的親和性

維生素D3化學(xué)結(jié)構(gòu)的改變會(huì)導(dǎo)致其與VDR結(jié)合方式的改變，繼而引起VDR構(gòu)象的變化，影響靶基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，最終改變維生素D3的生物學(xué)效價(jià)［11］。DBP作為血清中維生素D代謝產(chǎn)物的主要載體，以3個(gè)主要的多態(tài)性形式存在，不同形式的DBP對維生素D的生物學(xué)效價(jià)有潛在的影響。最近的研究表明，維生素D一些生物學(xué)功能的發(fā)揮與血清游離的25-(OH)D濃度關(guān)系更緊密，而非這種代謝產(chǎn)物的總濃度［12］。血清25-(OH)D的總濃度相對較低時(shí)其游離的25-(OH)D濃度較高，而DBP的高親和性可能導(dǎo)致游離的25-(OH)D濃度的降低［13］。除了運(yùn)輸功能外，DBP能夠?qū)⒀逯芯S生素D代謝產(chǎn)物的循環(huán)濃度維持在穩(wěn)定水平，而且DBP可延長維生素D及其代謝產(chǎn)物的半衰期，并使得它們更易被靶組織吸收，因此可以影響一些器官的代謝反應(yīng)，調(diào)節(jié)生物學(xué)效價(jià)［14］。

維生素D3的結(jié)構(gòu)改造主要包括側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)改造和A環(huán)的結(jié)構(gòu)改造。這些結(jié)構(gòu)的改造及構(gòu)象的修飾能夠改變維生素D與DBP及VDR的親和性，使它們與鈣代謝平衡調(diào)節(jié)、細(xì)胞誘導(dǎo)分化和增殖抑制等生物學(xué)功能徹底分離，從而影響維生素D的生物學(xué)活性。有研究表明，1α－羥基在維生素D與DBP及VDR結(jié)合的過程中至關(guān)重要，一些基團(tuán)取代1α－羥基后，其類似物的生物活性與1，25-(OH)2D3相比均有顯著降低［15－16］。隨C －2位α－羥烷基的碳原子數(shù)增加，類似物的VDR親和性及誘導(dǎo)細(xì)胞分化活性逐步升高，其中α－羥丙基的VDR親和性最高，為維生素 D3的3倍［17］。因此，進(jìn)一步研究活性維生素D3的構(gòu)效關(guān)系對于維生素D3生物學(xué)效價(jià)的研究發(fā)展十分必要。

3.1.2 關(guān)鍵酶的活性及其反饋調(diào)節(jié)機(jī)制

維生素D的代謝過程中有多種羥化酶發(fā)揮作用，其中起關(guān)鍵作用的酶主要是 CYP2R1、CYP27B1和24－羥化酶(CYP24)。它們的活性和基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平可通過正負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制受不同因素的調(diào)控。肝臟中的CYP2R1被認(rèn)為是維生素D發(fā)生25－羥基化所需的關(guān)鍵酶，CYP2R1基因發(fā)生突變后血清中25-(OH)D3循環(huán)水平降低，并同時(shí)出現(xiàn)典型的維生素D缺乏癥狀［18］。血清中25-(OH)D3能夠直接抑制CYP2R1的活性，這種負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制對于維持穩(wěn)定的血清25-(OH)D3水平非常重要［19］。

CYP27B1影響維生素D代謝產(chǎn)物的生物學(xué)效價(jià)，低鈣磷飼糧會(huì)導(dǎo)致CYP27B1活性的增加［23］，而高鈣低磷飼糧會(huì)下調(diào)腎臟CYP27B1基因表達(dá)水平，從而說明飼糧鈣對CYP27B1活性的影響較大，而飼糧磷對CYP27B1活性的影響不大［22］。除此之外，甲狀旁腺素(PTH)［20］、降鈣素［21］、催乳素［24］也可通過調(diào)節(jié) CYP27B1 基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)而影響1，25-(OH)2D3的合成。而單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中CYP27B1的調(diào)節(jié)機(jī)制與腎臟有所不同。由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的CYP27B1其基因受免疫刺激物(如γ－干擾素和脂多糖)的刺激通過多種途徑［如Janus激酶/轉(zhuǎn)錄激活因子(JAK/STAT)通路、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和核轉(zhuǎn)錄因子－κB(NF-κB)］而上調(diào)表達(dá)。免疫刺激也需要 CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白 β(C/EBPβ，又稱NF-IL6)結(jié)合到CYP27B1啟動(dòng)子區(qū)域的識別位點(diǎn)上才能實(shí)現(xiàn)對其轉(zhuǎn)錄的激活［25－26］。這表明動(dòng)物體的自身免疫狀態(tài)可以通過調(diào)控某些免疫細(xì)胞中CYP27B1基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)來影響維生素D代謝，從而影響維生素D的生物學(xué)效價(jià)。

腎臟中的CYP24可以羥基化25-(OH)D3和1，25-(OH)2D3，其主要功能是降低維生素D的生物學(xué)活性。CYP24與1，25-(OH)2D3之間是相互調(diào)節(jié)的，1，25-(OH)2D3刺激CYP24活性增強(qiáng)，而低鈣和低PTH抑制其活性。有研究表明，胎盤中CYP24活性的降低可導(dǎo)致胎兒－母體接口處1，25-(OH)2D3生物學(xué)效價(jià)的增加［27］。而轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ、SWI/SNF、輔活化子結(jié)合精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1(CARM1)和G9可與VDR共同作用于CYP24的轉(zhuǎn)錄調(diào)控［28－30］，成纖維細(xì)胞生長因子23(fibroblast growth factor 23，F(xiàn)GF23)和 klotho蛋白也可通過調(diào)節(jié)CYP27B1與CYP24基因的表達(dá)而參與1，25-(OH)2D3的自動(dòng)抑制調(diào)節(jié)，從而影響其生物學(xué)功能的發(fā)揮［31］。

3.2 影響維生素D生物學(xué)效價(jià)的外在因素

3.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物及光照

不同種類的動(dòng)物對維生素D的吸收利用能力差異很大。維生素D2和維生素D3的生物學(xué)效價(jià)在不同物種中所測得的結(jié)果存在一定的差異，而動(dòng)物的自身狀況(如免疫狀態(tài)［32］、年齡［33］、肥胖［34］等)也與維生素D的生物學(xué)效價(jià)有關(guān)。皮膚中的7－脫氫膽固醇經(jīng)紫外線照射形成維生素D3前體，進(jìn)而轉(zhuǎn)化成維生素D3。紫外線光照的變化顯著影響這一過程，進(jìn)而影響維生素D生物學(xué)效價(jià)的測定。有研究利用電腦建模技術(shù)估測，1單位最小紅斑劑量(MED)的紫外線光照在人體中可以產(chǎn)生相當(dāng)于口服16 000 IU維生素D的效力［38］。肉雞光照試驗(yàn)結(jié)果表明，皮膚經(jīng)紫外線照射所產(chǎn)生的膽鈣化醇量相當(dāng)于飼喂10 μg/kg的25-(OH)D3［40］或 20 μg/kg 的維生素 D3［39］。因此，紫外線照射強(qiáng)度的不同也是導(dǎo)致維生素D生物學(xué)效價(jià)沒有一致結(jié)論的因素之一。

3.2.2 評價(jià)指標(biāo)及評價(jià)方法

在維生素D生物學(xué)效價(jià)的研究試驗(yàn)中，采用不同的測定方法及指標(biāo)所測得的結(jié)果不同，生物學(xué)方法所測得的結(jié)果比化學(xué)方法要低20%左右。不同的試驗(yàn)采用的指標(biāo)各異，主要包括生產(chǎn)性能指標(biāo)(體重、日增重、采食量和料肉比)、脛骨指標(biāo)(骨灰分和骨鈣磷)、血清指標(biāo)［鈣磷水平、25-(OH)D水平、堿性磷酸酶活性］、鈣吸收代謝指標(biāo)(腸道鈣轉(zhuǎn)運(yùn)速率、骨鈣動(dòng)員速率)等。近年來，血清PTH水平也被作為評定維生素D生物學(xué)效價(jià)的指標(biāo)之一［35－36］。Emily 等［37］在鼠上測定維生素D2與維生素D3生物學(xué)效價(jià)時(shí)發(fā)現(xiàn)，以血清25-(OH)D水平為評價(jià)指標(biāo)時(shí)維生素D2的生物學(xué)效價(jià)低于維生素D3，而以骨礦物質(zhì)密度、骨礦物質(zhì)含量等為評價(jià)指標(biāo)時(shí)這兩者基本相等。因此，評價(jià)指標(biāo)及評價(jià)方法的選擇對于評價(jià)維生素D的生物學(xué)效價(jià)特別重要。

3.2.3 維生素D載體

飲食中維生素D的載體是不同的，一般包括油、粉末及乙醇。載體對維生素D的生物學(xué)效價(jià)有非常重要的影響［41］。有研究報(bào)道，乳糖作為維生素D載體時(shí)其效價(jià)是油的1.09倍［42］，是纖維素的1.42倍［43］;而油作為維生素 D載體時(shí)其效價(jià)是乙醇的 4.25 倍［44］，是多維的 1.13 倍［45］。乳脂性食品是維生素D理想的載體，因?yàn)槠渌闹境煞挚梢栽鰪?qiáng)脂溶性維生素D的穩(wěn)定性，促進(jìn)其吸收［46］，尤其是奶酪制品中所含的β－乳球蛋白和β－酪蛋白，能夠強(qiáng)力結(jié)合維生素D，形成保護(hù)性的結(jié)構(gòu)，避免在極性環(huán)境中被破壞，從而影響了維生素 D 的生物學(xué)效價(jià)［47－48］。

4 小結(jié)

隨著維生素D生物學(xué)效價(jià)評定方法的不斷完善及快速普及，研究的結(jié)果也逐步呈現(xiàn)出一致性，但由于某些影響因素的存在導(dǎo)致了一定的差異性，對維生素D生物學(xué)效價(jià)的研究仍然沒有統(tǒng)一的結(jié)論。因此，確定一個(gè)最合適的評價(jià)體系是今后研究的重點(diǎn)。此外，隨著流行病學(xué)、動(dòng)物學(xué)、細(xì)胞學(xué)、生物化學(xué)以及分子遺傳學(xué)研究的進(jìn)展，人們對維生素D的生物學(xué)功能有了更深一步的認(rèn)識，這為從細(xì)胞水平和分子水平上探究維生素D生物學(xué)效價(jià)新的評定方法提供了可能。

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