組織工程人工韌研究進(jìn)展＊

蔡長(zhǎng)儐綜述，楊 柳審校

（1.第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院關(guān)節(jié)外科中心，重慶 400038；2.解放軍77123部隊(duì)醫(yī)院，四川綿陽 621000）

前交叉韌帶（ACL）是膝關(guān)節(jié)內(nèi)一條重要的韌帶，同時(shí)它也是膝關(guān)節(jié)韌帶損傷中最常見的。在美國(guó)，每年有超過200 000例ACL損傷的病例，據(jù)估計(jì)每年直接花費(fèi)30億美元［1－2］。敖英芳等［3］在2000年報(bào)道，中國(guó)現(xiàn)役集訓(xùn)運(yùn)動(dòng)員前交叉韌帶損傷的總發(fā)病率為0.47%。臨床上ACL損傷也日益常見。最近一項(xiàng)研究［4］，在10年期間19 530例運(yùn)動(dòng)損傷患者，有37%的患者有膝關(guān)節(jié)損傷，其中45.4%的患者有不同程度的ACL損傷，并且33.9%的患者需要進(jìn)行手術(shù)治療，Majewski等［4］研究認(rèn)為現(xiàn)有的修復(fù)技術(shù)，長(zhǎng)期臨床觀察的成功率為85%～90%。

ACL起自股骨外髁內(nèi)側(cè)面后部，向前、向遠(yuǎn)端、向內(nèi)穿關(guān)節(jié)腔附著于脛骨平臺(tái)髁間棘前部［5］。平均長(zhǎng)度31～38mm，中間部分平均寬度為10～12mm，橫截面近似卵圓形，平均面積女性和男性分別為36mm和44mm。ACL組織學(xué)上屬于致密膠原組織。膠原纖維束呈平行排列，ACL主要細(xì)胞外基質(zhì)成分為Ⅰ型膠原、還含有Ⅲ型膠原、Ⅱ型膠原、V型膠原、彈性蛋白、蛋白多糖、水和細(xì)胞等。Ⅲ型膠原位于Ⅰ型膠原束間的疏松結(jié)締組織內(nèi)。研究表明，ACL極限抗張力強(qiáng)度為（2 020±264）N，最大形變（1 519±315）mm。ACL剛度為240 N／mm，彈性模量為278MPa，極限抗張強(qiáng)度為35MPa［6］。所受應(yīng)力變化與膝關(guān)節(jié)屈伸位置、肌肉收縮狀態(tài)、負(fù)重或者非負(fù)重都有關(guān)系。

1 ACL置換

ACL置換重建現(xiàn)有多種選擇，包括自體組織移植重建，異體組織移植重建和人工韌帶重建。自體移植（從患者其他部位取材移植），其中B-PT-B被認(rèn)為是治療 ACL損傷的金標(biāo)準(zhǔn)［7－8］。自體移植重建具有良好的力學(xué)強(qiáng)度，可促進(jìn)細(xì)胞增殖和組織生長(zhǎng)。從患者身上取材避免了排斥反應(yīng)和傳染疾病的危險(xiǎn)。但是，自體移植存在一些難以克服的問題：自體移植組織來源有限，而且需要從其他部位取材，有導(dǎo)致供區(qū)并發(fā)癥的可能［9］。同種異體移植重建（從尸體上取材移植）和自體移植重建具有同樣良好的力學(xué)強(qiáng)度，可促進(jìn)細(xì)胞增殖和組織生長(zhǎng)［10］，同時(shí)避免了從患者其他部位手術(shù)取材，沒有供區(qū)取材量的限制。但是，同種異體移植重建存在傳染疾病、感染、免疫排斥反應(yīng)的問題。而且移植物在消毒以后其力學(xué)性能也隨之改變［11］。由人工合成高分子材料制作的人工韌帶近年來在臨床治療中得到一定范圍的使用。人工合成高分子材料用于制作人工韌帶并應(yīng)用于臨床的有：聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯（Leeds-Keio韌帶、LARS）、碳纖維、聚四氟乙烯（Gore-Tex）、聚丙烯（Kennedy Ligament Augmentation Device）。其中 Leeds-Keio韌帶、LARS、Kennedy Ligament Augmentation Device是編織結(jié)構(gòu)的人工韌帶［12］。這些人工合成高分子材料制作的人工韌帶已經(jīng)通過美國(guó)FDA的相關(guān)測(cè)試，但由于上述人工韌帶存在變性、磨損、斷裂、導(dǎo)致滑膜炎，人工韌帶與骨界面結(jié)合不良、應(yīng)力遮擋、缺乏遠(yuǎn)期臨床療效報(bào)道和大規(guī)模對(duì)照研究等問題，因此，不推薦作為ACL修復(fù)的首選［13］。人工合成高分子材料制作的人工韌帶主要分為3類：永久替代型、加強(qiáng)型韌帶也稱為韌帶 加 強(qiáng) 裝 置 （ligament augmentation device，LAD）、支 架型14。永久替代型的人工韌帶要求在力學(xué)性能上與所替代的韌帶相近，它不能促進(jìn)組織向其內(nèi)部生長(zhǎng)。因此，此類韌帶存在疲勞和蠕變導(dǎo)致力學(xué)性能下降甚至斷裂的問題。加強(qiáng)型韌帶是用于自體移植重建或異體移植重建術(shù)后早期的力學(xué)加強(qiáng)，其本身的力學(xué)性能較差。支架型人工韌帶是一種具有多孔隙率，可促進(jìn)組織長(zhǎng)入的移植物，并且應(yīng)力由新生組織負(fù)荷的人工韌帶。這些人工合成高分子材料制作的人工韌帶在早期力學(xué)性能與正常的韌帶相近，但是，隨著時(shí)間的推移和反復(fù)應(yīng)力作用下，置換失敗率也不斷增加。與骨隧道的邊緣反復(fù)摩擦產(chǎn)生移植物的碎片，是導(dǎo)致關(guān)節(jié)滑膜炎的重要原因之一［15］。

2 ACL置換的新選擇

2.1 天然聚合物 可生物降解的組織工程移植物所用材料常見Ⅰ型膠原［16］和絲蛋白［17］。膠原的優(yōu)點(diǎn)在于能通過交叉耦合及其低抗原性改變支架的再吸收率和力學(xué)性能。這些支架經(jīng)歷了早期的機(jī)械強(qiáng)度降低和其術(shù)后10～20周的組織重塑，這種重塑伴隨著類似于自體移植的強(qiáng)度增加。纖維狀蛋白質(zhì)，如絲蛋白和膠原主要是由特殊的氨基酸序列構(gòu)成的。這種氨基酸序列反復(fù)出現(xiàn)于整個(gè)主要結(jié)構(gòu)中，形成了蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)的同質(zhì)性。這些蛋白質(zhì)中的這種堅(jiān)硬而延伸的結(jié)構(gòu)也賦予了它們置換承重材料所必需的力學(xué)性能，使它們成為很好的ACL重建支架材料。Altman和 Horan［18］開發(fā)了一種用于ACL置換重建的組織工程方法，將絲纖維構(gòu)建成合股纖維。這種絲纖維是一種分級(jí)結(jié)構(gòu)，由一束束繞成股的絲纖維組成，這些絲纖維股又繞成繩，繩又繞成了三維結(jié)構(gòu)。每一級(jí)的每一層朝著不同的方向繞。研究表明，這種絲纖維無細(xì)胞毒性，有利于細(xì)胞增殖。這種支架具有和天然ACL類似的力學(xué)性能。其最大載荷為2 000N，張力失效大約為39%，彈性模量350 Mpa。所有的數(shù)值均類似于天然ACL實(shí)驗(yàn)得出的數(shù)據(jù)。這種支架也具有類似韌帶和腱的3個(gè)階段的力學(xué)性能，支架結(jié)構(gòu)證明了腳趾區(qū)域及其后的線性區(qū)域。這種特性曲線對(duì)防止因疲勞和蠕變?cè)斐傻闹Ъ軗p傷很重要［19］。在其他一些研究中，Altman和Horan［18］通過用RGD序列覆蓋表層增加了絲纖維的生物適合性和再生能力，極大增強(qiáng)了骨髓間充質(zhì)細(xì)胞（BMSCs）的細(xì)胞附著、細(xì)胞增殖和分泌細(xì)胞外基質(zhì)。

2.2 人工合成聚合物 許多人工可降解的高分子材料，已被用于 ACL修復(fù)重建研究，常見的有聚乙醇酸（PGA）［20－21］、聚乳酸（PLA）［22］、聚碳酸酯（poly DTE carbonate）［23］、聚己內(nèi)酯（PCL）［24］、聚乙烯醇（PVA）及其共聚物［25－26］。使用人工合成高分子材料的優(yōu)點(diǎn)：支架材料來源不受限制，不傳染疾??；支架材料可生物降解，且不引起排斥反應(yīng)；可以通過改變材料的結(jié)晶度、分子量或改變共聚物中各聚合物配比來調(diào)節(jié)支架材料的力學(xué)性能及降解性能。

Cooper等［27］報(bào)道了一種復(fù)合種子細(xì)胞可降解，經(jīng)3D編織的聚L-乳酸（PLLA）韌帶支架。PLLA已通過美國(guó)FDA認(rèn)證，已有PLLA縫線在臨床應(yīng)用，PLLA不引起排異反應(yīng)，可逐漸降解，由正常組織所替代。與自體移植物不同，這些人工聚合物韌帶既不會(huì)傳染疾病，也不受來源的限制。這些支架在消毒后不會(huì)像天然支架材料那樣，力學(xué)性能下降［11］。與早期的人工合成高分子材料制備的人工韌帶（Leeds-Keio韌帶、Kennedy Ligament Augmentation Device）不同，PLLA的抗疲勞性較好。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，支架在降解后被正常組織完全替代。在降解實(shí)驗(yàn)中，PLLA纖維在8周的時(shí)間中力學(xué)性能只有輕微的改變26。在使用3D編織技術(shù)后的支架，在力學(xué)性能上與正常韌帶相近。支架使用編織技術(shù)后，抗磨損和抗斷裂的性能得到提高。支架的整體結(jié)構(gòu)得到加強(qiáng)，從而避免了因部分纖維的斷裂導(dǎo)致整個(gè)支架重建的失敗。編織增加了支架的孔隙率和孔通率，關(guān)節(jié)腔的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可以進(jìn)入支架內(nèi)，增加了細(xì)胞的附著面積，促進(jìn)了細(xì)胞的增殖和組織的長(zhǎng)入。此外，這種支架結(jié)構(gòu)由一種纖維狀、層次結(jié)構(gòu)、支架由類似正常韌帶膠原纖維直徑的微細(xì)纖維絲組成。這些微細(xì)纖維絲組成一束纖維，纖維排列成束經(jīng)編織后貫穿于整個(gè)支架。編織后的支架分為3部分：脛骨端、韌帶部分（關(guān)節(jié)腔內(nèi)部分）、股骨端。骨端和關(guān)節(jié)內(nèi)部分（韌帶）的孔徑是不同的，有研究表明骨組織長(zhǎng)入的最小孔徑為150μm，而軟組織長(zhǎng)入的最小孔徑為200～250μm。因此，不同的孔徑促進(jìn)了不同部位、相應(yīng)的組織和毛細(xì)血管的長(zhǎng)入［28］。

2.3 生物組織 由生物組織制備的移植物存在組織來源的隱患。最主要的隱患包括潛在疾病傳播、不良的免疫反應(yīng)和細(xì)菌感染。正如前面所說，對(duì)這些移植物進(jìn)行殺菌消毒而不改變它們的力學(xué)特性也是很困難的。其優(yōu)點(diǎn)使用時(shí)不需要在患者身上二次手術(shù)取材。這些移植物對(duì)于移植組織的供給是沒有限制的，它們有初始的力學(xué)強(qiáng)度（取決于組織的來源）?；谏锝M織的移植物也促進(jìn)了細(xì)胞增殖和新組織生長(zhǎng)。

最近，異種移植物（動(dòng)物組織）已經(jīng)成為了ACL修復(fù)的一種新選擇［29］。異種移植物有著和同種異體移植物同樣的優(yōu)勢(shì)和劣勢(shì)。它們可能也有把動(dòng)物身上的疾病傳播給人類宿主的風(fēng)險(xiǎn)以及免疫排異的風(fēng)險(xiǎn)。Stone和Abdel-Motal［30］研究表明處理過的異種移植物可能是ACL修復(fù)的一種可行的選擇。在研究中，經(jīng)過化學(xué)改性，來源于克隆豬的移植物被作為ACL替代物。研究成功的使用免疫化學(xué)改性和化學(xué)交聯(lián)處理后的豬移植物移植重建了ACL。

為了防止移植物的排異，ɑ-gal抗原決定部位從移植物中移除。天然抗Gal（anti-Gal）抗體和ɑ-gal抗原決定部位之間的相互作用阻礙了豬組織異種移植的使用。然而，最近缺乏ɑgal抗原決定部位的克隆豬排除了這種障礙。隨著ɑ-gal抗原決定部位的消除，研究中使用的ACL移植物通過脈沖沖洗以去除細(xì)胞成分，并和0.10%的戊二醛交聯(lián)12h。這樣處理后，用甘氨酸端來阻滯未反應(yīng)的戊二醛分子，并用17.8kGy放射滅菌。

在體內(nèi)試驗(yàn)中，處理后的豬移植物被植入獼猴體內(nèi)?？偣灿?0只獼猴被用于實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)觀察期分別是2、6、12個(gè)月。3只獼猴被用于2個(gè)月的實(shí)驗(yàn)，5只被用于6個(gè)月的實(shí)驗(yàn)，5只被用于12個(gè)月的實(shí)驗(yàn)。對(duì)照組7只獼猴。1只移植未處理的豬異種異體移植物和1只移植獼猴同種異體移植物，為期2個(gè)月；5只移植獼猴同種異體移植物，為期12個(gè)月。移植物和另一條腿上的完整韌帶通過了6個(gè)月（3個(gè)移植物）和12個(gè)月（10個(gè)移植物）的生物力學(xué)測(cè)試并進(jìn)行組織學(xué)檢查。處理后的豬骨－臏腱－骨移植物和未經(jīng)處理的冰凍的獼猴骨－臏腱－骨移植物被切成骨－腱構(gòu)造。這種植入移植物為長(zhǎng)30mm、寬4mm（腱材料）的移植物，兩端帶有直徑5mm、長(zhǎng)7mm的骨塊。

試驗(yàn)表明植入物促進(jìn)了新韌帶組織的再生。有跡象表明移植物重塑是從移植物邊緣擴(kuò)展到中心。此外，12個(gè)月后，豬移植物顯示出相當(dāng)?shù)臉O限負(fù)荷、屈服載荷、強(qiáng)度和極限位移。在6～12個(gè)月間，植入處理后移植物的強(qiáng)度從43%增加到了58%。然而不幸的是，移植物也表現(xiàn)出較低數(shù)值的極限強(qiáng)度、屈服強(qiáng)度、極限應(yīng)力和模量。雖然這些最終數(shù)值需要進(jìn)一步完善，但是負(fù)荷和移位數(shù)值表明這種移植系統(tǒng)正在成為一種ACL置換的可行選擇。伴隨著力學(xué)測(cè)試也進(jìn)行了獼猴對(duì)豬移植物的排異試驗(yàn)。血樣分別采集于手術(shù)前，第10、14、21、28、42和56天，以及第3、6、9和12個(gè)月，分析抗Gal和抗非Gal（anti-non-Gal）抗 體，比 如 豬 移 植 物 中 的 蛋 白 質(zhì) 抗 體。 用ELISA測(cè)定血清免疫球蛋白（Ig）、anti-Gal IgG和IgM活性。在植入手術(shù)后2周內(nèi)，和植入了處理后移植物（比未處理的低95%）的獼猴的anti-Gal濃度相比，植入了未處理豬移植物的獼猴的anti-Gal濃度（＞200%）有了極大的增加。對(duì)未處理移植物的強(qiáng)烈反應(yīng)表明存在急性排斥，會(huì)導(dǎo)致移植物的破壞和再吸收。據(jù)估計(jì)，植入處理后移植物的獼猴的anti-Gal濃度的微增可能是因?yàn)閷?duì)a-gal抗原決定部位的一種免疫反應(yīng)，a-gal抗原決定部位處于骨－韌帶－骨移植物的松質(zhì)骨縫隙的豬骨髓細(xì)胞。在植入術(shù)后8～12周，anti-Gal濃度達(dá)到了移植物植入前的數(shù)值。在一項(xiàng)專門研究中，豬移植物被植入了人體中作為ACL替代物。通過蛋白質(zhì)／免疫印跡法和ELISA的實(shí)驗(yàn)證明，人體產(chǎn)生了anti-non-Gal抗體來對(duì)抗多樣的豬異種蛋白?？贵w產(chǎn)生的水平在2～6個(gè)月達(dá)到頂峰，在2年后完全停止。沒有產(chǎn)生對(duì)抗人體韌帶蛋白的任何抗體。2年后，研究中5／6的患者完全適應(yīng)了豬移植物的功能。

3 展 望

ACL是復(fù)雜和高度有序的組織，它所具有的力學(xué)特性對(duì)于正常的膝關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)非常重要。為了在受傷后保持膝關(guān)節(jié)的功能，重建移植物一方面必須能夠承受適當(dāng)?shù)呢?fù)荷，另一方面要在短時(shí)期內(nèi)發(fā)揮類似的力學(xué)特性，同時(shí)促進(jìn)新的成熟韌帶的生長(zhǎng)，以承受長(zhǎng)時(shí)期的負(fù)荷［31］。組織工程韌帶支架可選材料包括天然聚合物、人工聚合物及生物組織。它們都可以滿足制造組織工程移植物的需要，包括結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和適當(dāng)?shù)牧W(xué)強(qiáng)度，細(xì)胞和組織生長(zhǎng)的促進(jìn)作用，以及緩慢降解并使新的組織承擔(dān)負(fù)荷的能力。生物活性和力學(xué)穩(wěn)定性的有機(jī)結(jié)合使這些移植物成為ACL置換很好的選擇。

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