內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激中未折疊蛋白反應與非酒精性脂肪性肝病的研究進展＊

王 軍 綜述，陳東風 審校

（第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所消化內(nèi)科，重慶400042）

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）是真核細胞中重要的細胞器，它是由封閉的膜系統(tǒng)和膜圍成的腔，形成互相溝通的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。早在1945年，由Porter等學者在對培養(yǎng)的小鼠成纖維細胞進行電鏡觀察時發(fā)現(xiàn)并命名。它是蛋白質(zhì)合成、折疊、組裝、運輸和細胞內(nèi)鈣儲存的主要場所，同時參與脂質(zhì)代謝和類固醇激素的合成。鈣離子穩(wěn)態(tài)的改變和未折疊或錯誤折疊蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的蓄積可以引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）。ERS是細胞的一種自我保護機制，主要表現(xiàn)為蛋白質(zhì)合成暫停、未折疊或錯誤折疊蛋白表達（UPR）和細胞凋亡等。

非酒精性脂肪肝?。∟AFLD）是一種與胰島素抵抗（IR）和遺傳易感性密切相關(guān)的代謝應激性肝臟損害，其病理學改變與酒精性肝?。ˋLD）相似，但患者無過量飲酒史，疾病譜包括非酒精性單純性脂肪肝（NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）及其相關(guān)肝硬化和肝細胞癌。NAFLD發(fā)病機制至今尚未完全明確，Day和James［1］提出的“二次打擊”學說已成為解釋該病發(fā)生機制的主要理論。初次打擊主要指IR和脂質(zhì)代謝紊亂所導致的肝細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，形成單純性脂肪肝。二次打擊主要指各種原因所致的氧化應激及脂質(zhì)過氧化損傷，引起NASH。國內(nèi)外相關(guān)研究顯示，ERS與NAFLD的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，現(xiàn)將ERS與NAFLD的關(guān)系綜述如下。

1 ERS及其誘發(fā)因素

當新合成的蛋白質(zhì)N末端糖基化、二硫鍵形成以及蛋白質(zhì)由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體轉(zhuǎn)運等過程受阻時，非折疊或錯誤折疊的新合成的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中大量堆積，或者是Ca2＋平衡狀態(tài)的打破，都會損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常生理功能，稱為ERS。根據(jù)誘發(fā)因素，ERS分為3種類型：（1）未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR）；（2）正確折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)過度蓄積激活細胞核因子κB（NF－κB）引發(fā)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超負荷反應（endoplasmic reticulum－overload response，EOR）；（3）固醇調(diào)節(jié)級聯(lián)反應。其中UPR與EOR是由蛋白質(zhì)加工紊亂所致，后者則是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面合成的膽固醇損耗所致［2］。

2 未折疊蛋白反應

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激發(fā)生初期，細胞通過改變其轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，減少蛋白的合成，降低進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白量，同時上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中分子伴侶和折疊蛋白的表達，增強內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白折疊功能；細胞還可以通過上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白降解途徑的相關(guān)基因表達，加速未折疊蛋白的降解過程。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)產(chǎn)生的這種適應性反應，即UPR。這是一種在進化過程中保留下來、相對保守的應答，對機體具有保護作用。

蛋白質(zhì)的正確折疊需要內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)分子的參與。其中主要有3類分子伴侶和折疊蛋白：熱休克蛋白家族（HSP）的葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白GRP78；外源凝集素類的鈣聯(lián)接蛋白（CNX）和鈣網(wǎng)織蛋白（CRT）；蛋白二硫化物異構(gòu)酶家族中的巰基氧化還原酶。這些伴侶蛋白能快速與轉(zhuǎn)運入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔的新合成蛋白結(jié)合，參與新蛋白的折疊、寡聚化、成熟等翻譯后修飾過程。其中葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白GRP78在UPR過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。GRP78又稱免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白（binding immunoglobulin heavy chain protein，BIP）。應激時，GRP78／BIP表達上調(diào)作用明顯，所以是ERS和UPR激活的標志蛋白。

典型的未折疊蛋白信號途徑：UPR需要3種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位蛋白參與：肌醇需要跨膜蛋白激酶和核酸內(nèi)切酶1α（IRE1α）、雙鏈RNA依賴蛋白激酶樣ER激酶（PERK）和活化轉(zhuǎn)錄因子6（ATF6）。以上3種應激感受蛋白都是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的跨膜蛋白，都有各自的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔結(jié)構(gòu)域檢測未折疊蛋白［3］。非ERS時，IRE1α、PERK和ATF6分別與GRP78／BIP結(jié)合處于不活躍階段；應激時，GRP78／BIP從上述3種膜蛋白上解離，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中的未折疊蛋白聚集，導致細胞質(zhì)內(nèi)結(jié)構(gòu)域二聚化，游離的IRE1α、PERK分別通過自身磷酸化而被激活。游離的ATF6進入高爾基體，通過蛋白酶水解成為活性轉(zhuǎn)錄因子［4］。上述分子伴侶表達上調(diào)可繼續(xù)輔助未折疊蛋白的折疊，蛋白質(zhì)折疊成原始的構(gòu)象，經(jīng)過修飾最終成為具有活性的功能性蛋白質(zhì)。只有正確折疊的蛋白質(zhì)，才能分泌進入高爾基體。如仍未正確折疊，則可進入細胞質(zhì)中經(jīng)泛素－蛋白酶體降解，這個過程稱內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解（ERAD）。適度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應有利于細胞在各種外界因素的刺激下恢復細胞穩(wěn)定，維持生存；過度或者持續(xù)應激則會啟動細胞凋亡程序。

3 未折疊蛋白反應與NAFLD發(fā)生的關(guān)聯(lián)通路

3.1 IRE1α－XBP1途徑 IRE1α一個內(nèi)切核糖核酸酶，通過非常規(guī)剪接XBP1信使RNA，激活 X－盒結(jié)合蛋白－1（XBP1），產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄的UPR原件和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應原件基因，控制ERAD和分子伴侶。IRE1α也降解信使RNA的許多分泌和跨膜蛋白，幫助減少進入ER的過載蛋白［5］。IRE1α介導酵母同源物ATF／CREB1（HAC1）mRNA剪接生成 HAC1p；IRE1α介導哺乳動物XBP1mRNA剪接生成XBP1s。下游途徑中IRE1α激活靶點包括HAC1p和XBP1s［6］，同時 HAC1p和XBP1s分別是酵母和哺乳動物細胞膜脂質(zhì)合成的關(guān)鍵因素［7－8］。研究證實：在NIH－3T3纖維母細胞中，只有對XBP1s增強表達，才能充分誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中最主要的磷脂成分卵磷脂的合成［9］。為研究小鼠出生后肝臟中XBP1的表達，Lee等［10］學者敲除小鼠表達XBP1的基因，血漿中三酰甘油、膽固醇和游離脂肪酸降低；分析小鼠的原代細胞，發(fā)現(xiàn)14碳醋酸生成脂肪酸和固醇類也是降低的，提示XBP1途徑需要脂質(zhì)更新。在飼養(yǎng)高蔗糖飲食的小鼠模型中，用染色質(zhì)免疫沉淀法實驗證實，XBP1也能結(jié)合生脂基因的啟動子。有研究表明：在小鼠胚胎期3T3－L1纖維母細胞中，IRE1α－XBP1途徑也與脂質(zhì)合成有著密切的聯(lián)系［11］。此外，有學者提出在胰島素抵抗及高胰島素血癥條件下，UPR中IRE1α－XBP1途徑能增加胰島素誘導肝臟脂肪生成能力，胰島素介導的蛋白合成與胰島素介導的生脂過程緊密相連［12］。

3.2 PERK－eIF2α途徑 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激時，PERK蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜寡聚化，隨即誘導自身磷酸化，激活其激酶活性。募集真核生物起始因子2（eIF2）的α亞單位使eIF2α上的N端第51位絲氨酸磷酸化，導致蛋白質(zhì)整體翻譯水平弱化。PERK和eIF2α的磷酸化也能出現(xiàn)在脂質(zhì)合成和脂肪肝的調(diào)控中，在小鼠乳腺上皮敲除PERK表達基因，游離脂肪酸減少和導致哺乳期小鼠生長遲緩［13］。eIF2α的磷酸化可以上調(diào)ATF4的表達，ATF4能上調(diào)CHOP、GADD34等蛋白的表達。有研究表明：ATF4雜合小鼠的表型包括避免年齡和飲食相關(guān)誘導肥胖和飲食誘導脂肪肝［14］。有學者利用GADD34的C末端活化碎片，在小鼠肝臟中，研究p－eIF2α信號調(diào)控作用［15］。轉(zhuǎn)基因?qū)е麓罅看x性適應：包括在小鼠飼養(yǎng)高脂飲食中的脂質(zhì)合成的降低。生脂基因核受體的低表達、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）及上游的PPARγ的調(diào)控子，CCAAT／增強結(jié)合蛋白α和－β（C／EBPα和C／EBPβ）都與脂質(zhì)合成的減少有關(guān)。

3.3 ATF6途徑 ATF6是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上Ⅱ型跨膜蛋白，具有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)、跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)3個結(jié)構(gòu)域，N端位于胞質(zhì)，含有一個堿性鋅指結(jié)構(gòu)（bZIP）的DNA轉(zhuǎn)錄激活功能域，C端位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)，具有多個BIP結(jié)合位點。在正常狀態(tài)下，ATF6和BIP形成穩(wěn)定的復合物停留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激時，ER腔內(nèi)的未折疊蛋白能使BIP和ATF6分離。ATF6以囊泡轉(zhuǎn)移的方式從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移到高爾基體，在高爾基體內(nèi)被蛋白酶S1P（site－1protease）和S2P（site－2protease）切割后激活［16］。ATF6和固醇調(diào)節(jié)原件結(jié)合蛋白s（SREBPs）都是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，能通過蛋白水解的分裂作用被激活?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)肝臟有3種SREBP：SREBP－1a、SREBP－1c、SREBP－2。其中SREBP－1c在三酰甘油、膽固醇和脂肪酸形成中起著關(guān)鍵作用，它能控制脂肪細胞的分化和脂肪在細胞內(nèi)的異位積聚作用。它能增加乙酰輔酶A合成酶的表達從而啟動脂肪生成，并能抑制線粒體轉(zhuǎn)運蛋白，促進TG正平衡，減少VLDL合成。肝臟SREBP－2過表達則使所有脂質(zhì)生成酶的mRNA增加，其中HMCoA還原酶mRNA增加量最明顯，而脂肪酸合成酶（FAS）的mRNA增加幅度相對較少。提示肝內(nèi)SREBP1c是成脂基因表達的重要調(diào)控者。研究證實：核形成的ATF6抑制SREBP2的轉(zhuǎn)錄活性通過其SREBP2復合物，征募組蛋白HDAC1［17］。因此，UPR 三個重要傳感器，PERK、IRE1α和ATF6α都能調(diào)控肝臟中脂質(zhì)儲存，都能與適當?shù)南掠蔚鞍谆駾NA相關(guān)蛋白結(jié)合發(fā)生作用。

4 未折疊蛋白反應和NAFLD的疾病進展

越來越多的證據(jù)表明，UPR在由NASH、糖尿病等代謝疾病引起的肝損害進展中起著關(guān)鍵作用［18］。NASH的肝臟病理學表現(xiàn)包括脂肪變性、炎癥、纖維化、細胞凋亡和壞死［19］。國內(nèi)外大量研究表明：胰島素激活、氧化應激、細胞因子信號調(diào)控途徑、炎癥、細菌內(nèi)毒素等因素之間相互作用可能與NAFLD進展有關(guān)，而UPR對NAFLD進展已有部分研究。

4.1 JNK 肥胖和胰島素抵抗在NAFLD的病理學表現(xiàn)中起著重要的作用［20］。研究表明：肝臟和脂肪組織中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在肥胖與胰島素活性退化中起著分子連接作用［21］。肥胖誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激通過UPR中IRE1α－JNK活化途徑降低胰島素信號，JNK－介導的胰島素受體基底物（IRS－1）抑制物引起的胰島素抵抗，其能促進肝臟脂肪變性，而同源蛋白3（TRB3）和JNK介導胰島素抵抗能導致高胰島素血癥及肝臟脂肪生成的增加。在蛋氨酸－膽堿飲食喂養(yǎng)小鼠中敲除JNK1，保留JNK2，能降低肝細胞三酰甘油累積、炎癥、肝損害和細胞凋亡［22］。此外，在肝細胞特定基因JNK1的消融表型中，能促進葡萄糖耐受不良、胰島素抵抗及脂肪肝［23］。因此，UPR中IRE1α介導JNK途徑，可能對NAFLD進展起著重要的作用。

4.2 氧化應激 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為蛋白折疊和二硫鍵的形成，提供良好的氧化環(huán)境。當氧化的蛋白折疊時，每一個二硫鍵形成生成一個活性氧。據(jù)估計分泌細胞每分鐘生成300～600萬個二硫鍵；因此，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白折疊、活性氧的生成與氧化應激存在密切的聯(lián)系［24］。細胞內(nèi)氧化應激能破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)和誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。研究表明：UPR通過轉(zhuǎn)錄因子Nrf2能激活抗氧化過程［25］。Nrf2屬于Collar家族亮氨酸拉鏈區(qū)轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控可誘導的抗氧化反應。Nrf2在肝臟和腎臟中高度表達，是UPR中PERK的亞基。研究表明：Nrf2刪除導致蛋氨酸膽堿缺乏飲食小鼠中脂肪型肝炎的快速進展［26］。此外，Nrf2缺乏小鼠在內(nèi)毒素、盲腸結(jié)扎、穿刺等因素引起的感染性休克中，死亡率增加［27］。上述研究已經(jīng)表明：Nrf2可能參與先天免疫反應的調(diào)控。正如前面提到的，UPR中PERK介導eIF2α的磷酸化作用也導致ATF4的上調(diào)。因此PERK和Nrf2必然有維持細胞內(nèi)谷胱甘肽水平的作用。由此推出：Nrf2與脂肪性肝炎有直接聯(lián)系。除了PERK之外，最近也有證據(jù)表明UPR中IRE1α－XBP1途徑也有抗氧化的調(diào)控作用［28］。

4.3 內(nèi)毒素 NASH患者中小腸細菌過度生長，腸源性內(nèi)毒素血癥、腸黏膜屏障功能減退等腸道環(huán)境的改變可能在NASH的發(fā)病機制中起重要作用［29］。血清內(nèi)毒素（LPS）可刺激肝臟產(chǎn)生腫瘤壞死因子（TNF）－α、白細胞介素（IL）－6等細胞因子，誘導炎性反應并引起肝臟壞死。同時，LPS能誘導正常狀態(tài)下肝臟的UPR活化及肝臟硬化癥小鼠肝臟中UPR的持續(xù)活化［30］。有研究證明，遺傳性肥胖小鼠較無肥胖的對照小鼠，對LPS損傷具有更高的敏感性，在暴露于小劑量LPS下NASH 進展更快［31］。

4.4 細胞凋亡 NASH患者中肝細胞凋亡的增加與疾病嚴重程度有關(guān)，因此，細胞凋亡可能是NAFLD進展的組成部分［32］。如果UPR不能改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激則會導致細胞凋亡。C／EBP同源蛋白（CHOP）是 UPR中重要的促凋亡蛋白。CHOP表達在人和哺乳動物中受ATF4或ATF6調(diào)控，CHOP缺失可以避免內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導的細胞凋亡。CHOP缺失在Akita小鼠中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導糖尿病和膽汁淤積誘導的肝纖維化的衰減中表達延遲［33］。但是，NAFLD中CHOP的作用機制還不清楚，但最近有研究表明：在CHOP敲除小鼠中，蛋氨酸膽堿缺乏飲食沒有誘導出肝損害［34］。

綜上所述，NAFLD脂質(zhì)來源包括飲食中乳糜顆粒殘余物、釋放脂肪組織中三酰甘油的游離脂肪酸以及新合成的脂肪組織。而ERS中的UPR途徑與脂質(zhì)合成的調(diào)控密切相關(guān)，且UPR嚴重度及其持續(xù)性與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激密切相關(guān)，UPR能通過ERS快速重建或維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，從而抑制脂肪肝的發(fā)生。盡管如此，迄今為止對UPR信號通路的細節(jié)還不明確，還存在很多問題，比如UPR是如何從保護細胞生存反應轉(zhuǎn)變?yōu)榇俚蛲龇磻?，最終導致細胞死亡。UPR過程中是否還有一些未知的信號轉(zhuǎn)導蛋白，而已知信號轉(zhuǎn)導蛋白是否存在其它未知底物。另外，應該怎樣設計UPR信號通路不同元件的基因缺陷動物模型，弄清各種疾病的發(fā)病機制，值得深入研究。

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