動物性產(chǎn)品中三聚氰胺的危害及檢測方法研究進(jìn)展

陳敏艷，劉 偉，郭抗抗＊，寧蓬勃

（1.陜西省獸藥監(jiān)測所，陜西西安 710016；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100）

三聚氰胺（melamine）又名2，4，6－三氨基－1，3，5－三嗪、蜜胺、三聚氰酰胺、氰脲三酰胺，主要用于合成三聚氰胺甲醛樹脂（melamine－formaldehyde），其作為工業(yè)原料還普遍存在于塑料、涂料等材料中。除此之外，三聚氰胺被添加于動物飼料中作為氮補充劑使用，同時也作為農(nóng)藥殺蟲劑如環(huán)丙三氨三嗪的代謝產(chǎn)物在實驗動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)［1］。目前國際上通用的測定飼料和食品中粗蛋白質(zhì)的含量的方法凱氏定氮法，其原理是以測定出的含氮量多少乘以6.25得出蛋白質(zhì)含量。三聚氰胺（含氮量66.67% ）添加到動物飼料或食品中能提高了虛擬蛋白質(zhì)的含量而被一些不法商販所利用，其在食品或飼料中進(jìn)行添加，以造成產(chǎn)品中蛋白質(zhì)含量較高的假象［2］。毒理學(xué)研究表明，動物長期大量攝入三聚氰胺會造成泌尿系統(tǒng)損害，引起腎小管間質(zhì)性腎炎、膀胱和腎結(jié)石，進(jìn)一步可引起細(xì)胞增生并誘發(fā)膀胱癌［3］，嚴(yán)重時可引起死亡。2007年3月，美國發(fā)生的因?qū)櫸锸称分刑砑尤矍璋范聞游锼劳鍪录?008年9月，中國發(fā)生因嬰幼兒食用三鹿嬰幼兒奶粉中含有三聚氰胺導(dǎo)致產(chǎn)生腎結(jié)石病癥的嚴(yán)重事件［2］。從而使人們對動物產(chǎn)品中三聚氰胺的殘留及危害引起重視。

1 三聚氰胺毒理學(xué)作用研究進(jìn)展

三聚氰胺可以通過消化道被快速吸收，在體內(nèi)只有少量或沒有代謝即通過尿液排出體外，半衰期為4 h～5h［4］。研究發(fā)現(xiàn)，通過靜脈注射（2mg／kg）或口服（5mg／kg）進(jìn)入SD大鼠體內(nèi)后，其迅速經(jīng)消化道吸收，且在給藥后1h血漿峰濃度達(dá)到61μg／mL，獲得的三聚氰胺在體內(nèi)的其他藥物代謝動力學(xué)參數(shù)，口服利用率（F）為73%±13%，平均穩(wěn)態(tài)分布體積（Vd）為103mL／kg±13mL／kg，血液清除率（CL）為20 mL／（h·kg－1）±4mL／（h·kg－1），這些數(shù)據(jù)表明三聚氰胺主要分布于血液和細(xì)胞外液中，在大多數(shù)組織內(nèi)沒有廣泛分布［5］。Chan J Y等［6］對三聚氰胺在體內(nèi)代謝后，在孕鼠體內(nèi)的胎盤羊水和哺乳期大鼠分泌的乳汁和胎兒分布的研究中發(fā)現(xiàn)，在強飼后0.5h有30%的三聚氰胺在胎兒體內(nèi)檢測到，在2h～3h后有大約20%的三聚氰胺在羊水中測到，母體吸收的三聚氰胺的40%會進(jìn)入母乳中，并在3h后達(dá)到峰值，研究發(fā)現(xiàn)三聚氰胺可透過胎盤屏障，進(jìn)入胎兒體內(nèi)，同時也會隨著母乳排出。Liu G等［7］對3只獼猴（平均體重5.8kg，1只雌性，2只雄性）體內(nèi)三聚氰胺（口服，1.4mg／kg）的毒物代謝動力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在血液中最大濃度可達(dá)1 767μg／L±252μg／L，在體內(nèi)達(dá)到最大濃度需要的時間為2.67h±1.16h，在體內(nèi)的半衰期為4.41h±0.43h，服用三聚氰胺后36h，在血液中檢測不到三聚氰胺的存在。Baynes R E等［8］對體內(nèi)三聚氰胺斷奶仔豬（靜脈注射，6.13mg／kg）研究發(fā)現(xiàn)，其在體內(nèi)的半衰期大約為4h，血液清除率為110mL／h，平均穩(wěn)態(tài)分布體積為0.61L／kg。對泌乳羊體內(nèi)的三聚氰胺代謝動力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，其平均穩(wěn)態(tài)分布體積為單胃動物的6倍，分析其原因可能是瘤胃作為一個額外的儲存器［9］，說明了三聚氰胺在復(fù)胃動物體內(nèi)含量高于單胃動物。

目前，三聚氰胺在家畜體內(nèi)的毒理學(xué)作用的研究數(shù)據(jù)很有限。無可見有害作用水平（no observed adverse effect level，NOAEL）作為評價某種有害物質(zhì)對動物機體危害的統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)在對有害物質(zhì)進(jìn)行風(fēng)險分析時有重要參考價值。三聚氰胺的NOAEL在奶牛體內(nèi)是每日27mg／kg，在豬是每日400mg／kg，而對鮭魚、鱒魚、鯰魚、羅非魚等約為每日400mg／kg，貓體內(nèi)是每日180mg／kg［10］。對于人類的研究則是基于2008年在中國發(fā)生的嬰兒奶粉摻假事件導(dǎo)致嬰兒產(chǎn)生腎結(jié)石，歐洲食品安全局CONTAM小組通過構(gòu)建基于嬰兒出生體重及每日攝取的三聚氰胺的數(shù)據(jù)模型估計出的10%腫瘤發(fā)生率的低側(cè)可信限（benchmark dose lower confidence limit，BDML10）是每日0.74mg／kg［3］。

針對出現(xiàn)的三聚氰胺出現(xiàn)的食品安全事件，世界各衛(wèi)生監(jiān)督機構(gòu)紛紛對三聚氰胺設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)，美國食品與藥物管理局針對三聚氰胺及其類似物設(shè)置的每日容許 攝 入 量 （tolerable daily intake，TDI）是 0.63 mg／kg，歐盟委員會設(shè)立的 TDI是2.5mg／kg，世界衛(wèi)生組織針對三氯氰胺設(shè)立的TDI是每日0.2 mg／kg［3］。我國在2008年10月7日頒布《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》國家標(biāo)準(zhǔn)GB／T 22388－2008，標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了高效液相色譜法、氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色譜－質(zhì)譜／質(zhì)譜法三種方法為三聚氰胺的檢測方法，檢測定量限分別為2、0.05、0.01mg／kg。

2 三聚氰胺檢測方法進(jìn)展

傳統(tǒng)的三聚氰胺檢測方法主要有苦味酸法和升華法，主要針對工業(yè)用三聚氰胺的檢測。隨著三聚氰胺在寵物食品和嬰兒奶粉中出現(xiàn)等食品安全事件的發(fā)生，三聚氰胺在食品中新檢測方法不斷涌現(xiàn)。同時，國家標(biāo)準(zhǔn)也規(guī)定了以高效液相色譜法、氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色譜－質(zhì)譜／質(zhì)譜法三種方法為三聚氰胺的檢測方法。

2.1 國家規(guī)定的檢測方法

高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）是在經(jīng)典色譜法的基礎(chǔ)上，引用了氣相色譜的理論，流動相改為高壓輸送；色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜，是目前對三聚氰胺進(jìn)行檢測的國標(biāo)方法。操作中先將樣品進(jìn)行預(yù)處理后經(jīng)C8色譜柱的分離后，加入流動相為乙腈－緩沖液（10 mmol／L檸檬酸，10mmol／L辛烷磺酸鈉，調(diào)節(jié)pH至3.0）＝15∶85，檢測波長240nm，用紫外檢測器進(jìn)行檢測和定量，此法的量限為2mg／kg［2］。有報道采用乙腈－緩沖液為提取液，再用MCX柱凈化后進(jìn)行HPLC分析，飽和醋酸鉛可較好的沉淀食品中的大量的蛋白類物質(zhì)。MCX柱與三聚氰胺的有效結(jié)合，可被0.1mol／L的鹽酸溶液和甲醇溶液所淋洗下來，因此可有效適用于食品樣品的凈化處理［10］。

氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法（gas chromatography－mass spectroscopy，GC－MS）是利用氣相色譜柱根據(jù)試樣組分分子的化學(xué)性質(zhì)差異對化合物進(jìn)行分離，再利用質(zhì)譜法對分離得到的分子進(jìn)行離子化并并通過其質(zhì)荷比來鑒定。2007年6月14日農(nóng)業(yè)部發(fā)布了三聚氰胺的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法（NY／T 1372－2007），規(guī)定測定飼料中三聚氰胺含量的HPLC方法和GC－MS法，GC－MS作為陽性確證法［11］。呂燕等［12］建立了雞蛋中三聚氰胺氣相色譜－質(zhì)譜分析方法，靈敏度達(dá)到0.005 mg／kg；研究發(fā)現(xiàn)飼喂三聚氰胺飼料后的雞蛋中三聚氰胺含量快速上升，最高達(dá)到3.88mg／kg（A組）和16.28mg／kg（B組），停喂后雞蛋中三聚氰胺含量則快速下降。

液相色譜－質(zhì)譜法（liquid chromatography－mass spectrometry，LC－MS）是先采用液相色譜技術(shù)對樣品進(jìn)行前期分離，然后用質(zhì)譜方法對不同LC洗脫成分進(jìn)行分析的方法。此法廣泛應(yīng)用于生物材料的三聚氰胺檢測。已有研究者建立了豬肉、魚肉、腎臟組織中三聚氰胺檢測的LC－MS方法，能快速有效地發(fā)現(xiàn)這些組織中三聚氰胺的殘留，可用于動物產(chǎn)品中殘留的檢測［13－15］。Wu Y T等［16］使用 LC－MS方法分別對飼喂三聚氰胺SD大鼠的血漿、肝臟、腎臟、脾臟、膀胱和大腦組織中殘留三聚氰胺進(jìn)行檢測，其檢測極限（limit of detection，LOD）分別為5.6、8.9、7.2、4.2、5.4、8.3ng／mL，同時進(jìn)一步證實腎臟是三聚氰胺殘留量最高的器官。吳慶慶等［17］發(fā)展了一種反相液相色譜－質(zhì)譜的三聚氰胺檢測方法，其主要采用一種質(zhì)譜兼容離子對試劑七氟丁酸（HFBA），可使三聚氰胺在反相液相色譜上被保留和分離，且不干擾質(zhì)譜的在線檢測。其對三聚氰胺的檢測限量為0.1ng／g，在液態(tài)奶中限量為8ng／g。李秀琴等［18］使用LC－MS方法對14種食品殘留的三聚氰胺進(jìn)行檢測，系統(tǒng)的考察了不同蛋白沉淀劑和提取劑的回收率，發(fā)現(xiàn)鮮蛋及蛋制品適合于用乙腈作為蛋白沉淀劑，乙腈水溶液作為提取溶劑效果較好。

2.2 其他方法

親水作用液相色譜法（hydrophilic interaction liquid chromatography，HILIC）是一種使用極性化合物作為正相液相色譜柱，如硅膠柱，適合用于分離強極性堿性有機物，而避免的反相柱液相色譜法中強極性化合物在柱中不能保留或保留很少的弊端。Zheng X L等［19］用NH2柱，利用乙腈－H3PO4作為流動相，并在215nm的紫外下對乳品中的三聚氰胺進(jìn)行檢測，建立的方法的檢測限量是3mg／mL。

酶聯(lián) 免 疫 吸 附 試 驗 （enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）也可用于動物產(chǎn)品中三聚氰胺殘留的檢測，其主要是用三聚氰胺—辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）偶合物作為標(biāo)準(zhǔn)品，與樣品中萃取的三聚氰胺和三聚氰胺－HRP酶偶合物與三聚氰胺抗體結(jié)合；經(jīng)過30min的培養(yǎng)，任何沒有結(jié)合的三聚氰胺和HRP酶偶合物將被沖洗掉，顯色酶底物加入微孔中，任何結(jié)合的酶偶合物都會顯色；等反應(yīng)結(jié)束后，用酶標(biāo)儀讀數(shù)，再將未知樣品的讀數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)品的讀數(shù)比較，就能得出樣品中三聚氰胺濃度［11］。Liu J X等［20］對肌肉組織用氨乙腈進(jìn)行處理后，在ELISA反應(yīng)之前通過微孔對樣品進(jìn)行提純，該法檢測三聚氰胺的限量是1.8ng／g。Wang Z Y等［21］建立一種用于豬肉和雞肉中三聚氰胺殘留檢測的ELISA方法，檢測限量是0.05μg／mL，其用所建立的方法檢測家兔體內(nèi)血漿、肌肉、肝臟和腎臟中三聚氰胺殘留量，發(fā)現(xiàn)在相同的三聚氰胺飼喂量下，腎臟組織中的測到的殘留量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他器官；停止喂給三聚氰胺7d后對相同的組織器官的三聚氰胺殘留量進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，三聚氰胺的濃度快速下降，只有腎臟可以測到少量殘留。這些結(jié)果也證實了關(guān)于動物在暴露于少量三聚氰胺污染的環(huán)境下，動物可食性機體組織對人類不構(gòu)成危害的報道。

高錳酸鉀氧化吖啶紅熒光動力學(xué)法是一種基于在酸性條件下，高錳酸鉀氧化吖啶紅的褪色效應(yīng)可被三聚氰胺所抑制，而吖啶紅可以產(chǎn)生熒光而被檢測到。Feng W等［22］建立的該方法對液態(tài)奶進(jìn)行檢測，其檢測到的限量是61.5ng／L，此種方法簡單，但是易受外界雜質(zhì)如蛋白的干擾，因此在一定程度上限制了應(yīng)用。

3 小結(jié)

三聚氰胺本身是一種化工原料，經(jīng)不同途徑進(jìn)入動物產(chǎn)品或動物飼料，被食用后可引機體的起多種損害，主要表現(xiàn)為腎臟中有結(jié)晶出現(xiàn)，試驗條件下試驗動物還會出現(xiàn)尿毒癥，以及多種臨床表現(xiàn)，如厭食、嘔吐、嗜睡、多尿、氮質(zhì)血癥等。同時，有研究發(fā)現(xiàn)三聚氰胺還可以導(dǎo)致精子畸形率的增加以及DNA損傷［23］。關(guān)于人類在食用含有三聚氰胺殘留的動物產(chǎn)品后其在體內(nèi)的毒理學(xué)作用研究資料還不是很多，還需要進(jìn)一步研究其對人體健康更深遠(yuǎn)的危害。目前，檢測三聚氰胺的方法主要是利用色譜法，但其操作不夠簡便、成本較高限制了在基層的應(yīng)用。因此，建立快速、敏感、低成本、適用于臨場檢測的檢測方法是一個重要的方面。另外，待檢樣品的前期處理對結(jié)果影響很大，尤其是生物性樣品。因此，針對不同樣品材料的前期處理摸索無疑成為一項重要任務(wù)。

［1］陽麗芝，陳志偉.三聚氰胺檢測技術(shù)研究進(jìn)展［J］.生命科學(xué)儀器，2009，7（5）：15－18.

［2］朱鶴云，關(guān) 皎，王黎明.三聚氰胺檢測方法的國內(nèi)外研究進(jìn)展［J］.吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報，2010，31（5）：289－292.

［3］Dorne J L，Doerge D R，Vandenbroeck M，et al.Recent advances in the risk assessment of melamine and cyanuric acid in animal feed［J］.Toxicolol Appl Pharmacol，2012，1（12）：1016－1027.

［4］Mast R W，Jeffcoat A R，Sadler B M，et al.Metabolism disposition and excretion of［14C］melamine in male Fischer 344rats［J］.Food Chem Toxicol，1983，21（6）：807－810.

［5］Yang F，Mao Y，Zhang X，et al.LC－MS／MS method for the determination of melamine in rat plasma：Toxicokinetic study in Sprague－Dawley rats［J］.Separa Sci，2009，32（17）：2974－2978.

［6］Chan J Y，Lau C M，Cheng F P，et al.Gestational and lactational transfer of melamine following gavage administration of a single dose to rats［J］.Food Chem Toxicol，2011，49（7）：1544－1548.

［7］Liu G，Li S，Jia C，et al.Pharmacokinetic study of melamine in rhesus monkey after a single oral administration of a tolerable daily intake dose［J］.Regulat Toxicol Pharmacol，2010，56（2）：193－196.

［8］Baynes R E，Smith G，Mason S E，et al.Pharmacokinetics of melamine in pigs following intravenous administration［J］.Food Chem Toxicol，2008，46（3）：1196－1200.

［9］Baynes R E，Barlow B，Mason S E，et al.Disposition of melamine residues in blood and milk from dairy goats exposed to an oral bolus of melamine［J］.Food Chem Toxicol，2010，48（8）：2542－2546.

［10］馮家望，余以剛，歐陽穎瑜，等.食品中三聚氰胺的檢測技術(shù)現(xiàn)狀與展望［J］.現(xiàn)代食品科技，2008，24（10）：1048－1051.

［11］杜 瑋，傅 強.三聚氰胺檢測方法的研究進(jìn)展［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2009，19（1）：236－239.

［12］呂 燕，孫澤祥，楊 挺，等.雞蛋中三聚氰胺檢測方法與殘留消除規(guī)律研究［J］.寧波農(nóng)業(yè)科技，2009（3）：2－4.

［13］Michael S，Alexander J K.Interim method for determination of melamine and cyanuric acid residues in food using LC－MS／MS［J］.US Food and Drug Administration，2008，9（10）：1－27.

［14］Wendy C A，Sherri B T，Christine M K，et al.Determination of melamine residues in catfish tissue by triple quadrupole LC－MS／MS with HILIC chromatography［J］.US Food and Drug Administration，2007，23（5）：1－8.

［15］Michael S F，Elizabeth R T.The determination of melamine in muscle tissue by liquid chromatography／tandem mass spectrometry［J］.Rapid Communications Mass Spectrometry，2007，21（24）：4027－4032.

［16］Wu Y T，Huang C M，Lin C C，et al.Determination of melamine in rat plasma，liver，kidney，spleen，bladder and brain by liquid chromatography－tandem mass spectrometry［J］.J Chromatography A，2009，1216（44）：7595－7601.

［17］吳慶慶，范可欣，沙 偉，等.基于反相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用的高靈敏度三聚氰胺檢測新方法［J］.科學(xué)通報，2009，54（2）：171－176.

［18］李秀琴，張慶合，全 燦，等.液相色譜－質(zhì)譜／質(zhì)譜法對多種食品基體中的三聚氰胺的檢測［J］.分析測試學(xué)報，2009，28（11）：1260－1265.

［19］Zheng X L，Yu B S，Li K X，et al.Determination of melamine in dairy products by HILIC－UV with NH2column［J］.Food Control，2012，23（1）：245－250.

［20］Liu J X，Zhong Y B，Liu J，et al.An enzyme linked immunosorbent assay for the determination of cyromazine and melamine residues in animal muscle tissues［J］.Food Control，2010，21（11）：1482－1487.

［21］Wang Z Y，Ma X，Zhang L Y，et al.Screening and determination of melamine residues in tissue and body fluid samples［J］.Analytica Chimica Acta，2010，662（1）：69－75.

［22］Feng W，Lv C Y，Yang L P，et al.Determination of melamine concentrations in dairy samples［J］.Food Sci Technol，2012，47（1）：147－153.

［23］Zhang Q X，Yang G Y，Li J T，et al.Melamine induces sperm DNA damage and abnormality，but not genetic toxicity［J］.Regulat Toxicol and Pharmacol，2011，60（4）：144－150.