豬博卡病毒檢測方法研究進展

莊金秋，梅建國，沈志強

（1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600；2.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，吉林長春 130062）

博卡病毒（Bocavirus）為細小病毒科細小病毒亞科博卡病毒屬成員，博卡病毒屬包括牛博卡病毒、人博卡病毒（1型～4型）、犬博卡病毒（1型）和豬博卡病毒4種［1］。人博卡病毒最早于2005年在一名表現(xiàn)下呼吸道疾病的瑞典兒童體內(nèi)經(jīng)PCR技術(shù)被首先鑒定，其基因組大小為5.2kb左右，為無囊膜單股線狀DNA病毒［2］。目前，已有許多國家報道人博卡病毒病的流行［3］。豬博卡病毒（Porcine Bocavirus，PBoV）則于2009年首次由瑞典科研人員從表現(xiàn)斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）的瑞典發(fā)病豬群中被檢出并鑒定［4］。目前，豬博卡病毒作為新發(fā)現(xiàn)的病原，已成為世界各國科研人員研究的熱點。研究表明，豬博卡病毒除了與細小病毒科其他成員同有2個開放閱讀框架（ORF1和ORF2）外，還在非結(jié)構(gòu)蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)之間有第3個開放閱讀框架（ORF3），編碼1個高度磷酸化的功能尚未弄清的非結(jié)構(gòu)性蛋白質(zhì)。ORF1編碼1個與病毒基因復(fù)制有關(guān)的非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，ORF2編碼2個衣殼蛋白（VP1和VP2）。根據(jù)ORF2編碼的VP1病毒蛋白的不同，已報道的6個豬博卡病毒可分為4個型（PBoV1～PBoV4）［5－6］。

1 博卡病毒的發(fā)現(xiàn)

2009年，瑞典科研人員運用隨機多重置換擴增方法（random multiple displacement amplification，MDA）（病毒宏基因組研究方法之一）和高通量測序技術(shù)在患PMWS的豬淋巴結(jié)中擴增出了一段長1 879bp的核苷酸序列，將該段序列與已知病毒序列比較，發(fā)現(xiàn)其完整的NP1基因及部分VP1／VP2基因與人類博卡病毒相近，故將該病毒歸類為細小病毒科、細小病毒亞科、博卡病毒屬［7－8］。

2 博卡病毒與疾病的相關(guān)性

目前，在歐洲一些國家和我國均已報道了PBoV在豬群中的流行狀況，顯示在健康豬群和表現(xiàn)呼吸道癥狀的豬群中均檢出較高的陽性率，可見其流行面很廣。由于對PBoV的研究才剛剛起步，對其全基因組大小、體外培養(yǎng)細胞系、物理化學(xué)性質(zhì)、傳播途徑等方面都不甚明了，因而其單獨的致病性不得而知。但PBoV在病豬體內(nèi)被檢出，暗示其對豬有一定的致病性。多數(shù)（PBoV1、PBoV2及PBoV4）分離自患PMWS的病豬，并且在病豬的檢出率高于健康豬。這表明PBoV與PMWS的發(fā)生有一定相關(guān)性，其也可能與豬圓環(huán)病毒2型（PCV－2）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）和豬瘟病毒（CSFV）等病原混合感染導(dǎo)致豬發(fā)生更嚴重的疾?。?－10］。自2006年，我國暴發(fā)豬高熱病以來，其主要病原被確定為PRRSV，但在PRRSV陽性的病料中也頻繁地檢出PCV－2、豬偽狂犬病病毒（PRV）及CSFV等，而在這些病料中PBoV也被檢出，而且陽性率大于70%以上，并且病豬表現(xiàn)明顯的呼吸癥狀及肺組織損傷。這表明PBoV可能在豬高熱病中也扮演一定的角色，其致病機理有待于進一步研究［11］。2010年至今中國部分地區(qū)規(guī)模豬場暴發(fā)流行的仔豬嚴重腹瀉，哺乳仔豬多在出生2d～3d后出現(xiàn)劇烈的腹瀉，呈黃綠色、淡綠色或灰白色水樣糞便，部分仔豬有嘔吐癥狀，迅速脫水消瘦，病豬精神沉郁、被毛粗亂，少吃或不吃、脫水消瘦，一般于5d～7d內(nèi)死亡，10日齡以內(nèi)的仔豬死亡率高達50%～80%，隨日齡的增加死亡率降低。病死豬尸體消瘦、脫水、胃黏膜充血，有時有出血點，小腸黏膜充血，腸壁變薄無彈性，內(nèi)含水樣稀便，腸系膜淋巴結(jié)腫脹。同一豬場內(nèi)母豬和育肥豬無明顯癥狀。按照流行性腹瀉、傳染性胃腸炎和輪狀病毒處理，基本無明顯效果。有些豬場調(diào)整免疫程序，做了豬瘟或者偽狂犬病乳前免疫接種，效果很差。一些學(xué)者也推測可能與PBoV感染存在關(guān)聯(lián)。雖然尚未弄清PBoV感染的臨床意義和流行病學(xué)特征，但值得關(guān)注和持續(xù)性監(jiān)測。

3博卡病毒的培養(yǎng)與檢測

3.1博卡病毒的培養(yǎng)

目前，只有北愛爾蘭科研人員McKillen J等［12］對豬博卡病毒的細胞適應(yīng)性進行了研究，其可以在豬原代腎細胞上生長且經(jīng)過培養(yǎng)4代后，導(dǎo)致細胞出現(xiàn)明顯的細胞病變。他們在北愛爾蘭豬糞便樣品的細胞培養(yǎng)物中分離到2株豬博卡病毒，經(jīng)基因分型分析確認為PBoV3和PBoV4型。此外，該研究還對細胞培養(yǎng)液進行收集、梯度離心處理，電鏡觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離的病毒直徑大小為25nm～30 nm，與其他細小病毒亞科成員的病毒粒子大小相似。

3.2博卡病毒的檢測

3.2.1聚合酶鏈反應(yīng) 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測方法是分子水平上常用的方法之一，具有很好的敏感性、重復(fù)性和特異性，已廣泛應(yīng)用于動物疫病的檢測。瑞典學(xué)者Blomstrom A L等［4］（采用PCR技術(shù)對34頭患PMWS的病豬和24頭健康豬進行了PCV－2、豬輸血傳播病毒（PTTV）和PBoV的檢測，結(jié)果PMWS病豬中PBoV陽性率為88%，而健康豬群陽性率為46%，說明PBoV可能在PMWS致病作用中參與了共感染。Cadar D等［13］（于2006年－2007年和2010年－2011年狩獵季節(jié)在羅馬尼亞西部地區(qū)采集了842頭份野豬樣品，經(jīng)PCR檢測，共檢出PBoV陽性樣品109份，陽性率為12.94%，其中2006年－2007年狩獵的野豬樣品的陽性率為9.14%（43／470），而2010年－2011年狩獵的野豬樣品的陽性率為17.74%（66／372），顯示出攀升趨勢。不同年齡段野豬陽性率存在差異，其中6月齡～12月齡的野豬陽性率為77.06%（84／109），12月齡～36月齡的野豬陽性率為22.94%（25／109），說明PBoV感染主要發(fā)生在低年齡段豬群。經(jīng)基因測序，表明野豬和家豬的PBoV基因同源性很高。國內(nèi)翟少倫等［11］建立了PBoV1的PCR診斷方法，并對2009年來自江西、浙江等9個省市送檢的191份疑似豬高熱病病料（組織樣品108份，血清76份和精液7份）進行檢測，結(jié)果檢出PBoV陽性樣品75份，陽性率為39.3%（75／191），表明我國豬群中豬博卡病毒相當(dāng)流行。他們建立的PCR方法敏感性、重復(fù)性和特異性均較好，敏感性達32.2ng／μL。Zhai S L等［6］對中國豬群中PBoV的感染情況進行了調(diào)查。經(jīng)PCR檢測，發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)呼吸道病癥的斷奶豬PBoV陽性率達69.7%（69／99），其他豬群陽性率為0～13.6%，暗示PBoV可能在豬呼吸道疾患中扮演一定的角色。對部分VP1／2基因序列進行分析，發(fā)現(xiàn)與參考毒株同源性達99%～100%，僅在5個核苷酸位點發(fā)生突變。Zhang H B等［14］于2010年收集了中國10個省份的166份樣品進行豬博卡病毒分型檢測，結(jié)果PBoV1～PBoV4型的檢測率分別為28.9%、6.6%、19.3%和39.7%，說明中國豬群中PBoV感染狀況非常復(fù)雜。Lau S K等［15］從中國香港生豬屠宰場和養(yǎng)豬場的健康豬和病死豬中采集了淋巴結(jié)、血清和糞便等樣品共333份，采用PCR技術(shù)檢出PBoV陽性樣品55份，總陽性率為16.5%。經(jīng)對病毒全基因組序列的測定，表明存在2個型別的PBoV，即PBoV3和PBoV4，推測可能在豬體內(nèi)不同PBoV毒株間發(fā)生了變異和重組。李彬等［16］建立了檢測PBoV的PCR檢測方法。陽性樣品可出現(xiàn)約為270bp的片段。他們建立的檢測方法敏感性高、特異性好、操作簡便、迅速，并且對檢測材料質(zhì)量要求低，便于臨床應(yīng)用。總之，已經(jīng)建立了越來越多的PBoV的PCR檢測方法并被應(yīng)用于臨床樣品的檢測。

3.2.2 實時定量聚合酶鏈反應(yīng) 實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（Real－time PCR）是在PCR的基礎(chǔ)上建立起來的診斷方法，由于省去了普通PCR需要凝膠成像的步驟，可以大大縮短疫病的檢測時間。Li B等［17］建立了檢測PBoV的Real－time PCR方法，經(jīng)對258份豬樣品的檢測，檢出陽性樣品114份，總陽性率為44.2%（114／258）。發(fā)病豬群的PBoV 陽性率明顯要高，達56.1%（101／180），而健康豬群的陽性率則為16.7%（13／78）。他們建立的real－time PCR 方法，敏感性、重復(fù)性和特異性均較好，敏感性達20個質(zhì)?？截?。黃律等［18］立的PBoV2 Taq Man熒光定量PCR方法，結(jié)果表明PBoV2最低核酸檢出量為67.3拷貝／μL。

3.2.3 間接免疫熒光法 McKillen J等［12］建立了PBoV的原代細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，同時為了鑒定病毒在細胞上的生長情況，還建立了間接免疫熒光方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)綠色熒光集中在豬原代腎細胞的細胞核。

3.2.4 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）技術(shù) 李彬等［19］建立了一種豬博卡病毒的LAMP檢測方法并組裝了檢測試劑盒，該試劑盒包含4條引物，檢測時首先按照常規(guī)方法提取待檢樣品的核酸，然后利用LAMP檢測試劑盒檢測樣品核酸，從而判斷樣品中是否含有豬博卡病毒。他們研制的試劑盒使用簡單，結(jié)果直觀，特異性及敏感性高。

此外，李彬等［20］報道對PBoV1的NP1基因進行原核表達，研究結(jié)果表明NP1蛋白可作為診斷抗原的候選蛋白，這也為PBoV1的血清學(xué)診斷積累了材料。

4 結(jié)語

PBoV作為豬群中的一種新發(fā)現(xiàn)病原，自2009年以來，人類對它的研究正逐步深入。盡管在其病原學(xué)、流行病學(xué)、診斷方法等方面取得了很大的突破，但在其基因型分型、致病性、感染性克隆、穩(wěn)定的體外培養(yǎng)系統(tǒng)、鑒別診斷方法等方面的研究還比較薄弱。雖然表明本病毒可能是豬呼吸道疾患的致病因子之一，并且與臨床豬病發(fā)生具有潛在關(guān)聯(lián)，常與PCV－2、PTTV和PRRSV等發(fā)生混合感染，但其致病機理以及在PMWS中扮演的角色需要進一步的研究。同時在健康豬群相關(guān)樣品中也能檢測到較高的博卡病毒陽性率，說明豬博卡病毒感染的廣泛存在。因此，只有對其臨床表現(xiàn)、致病機理、傳播機制和基因遺傳演化等方面進行更深入的研究，才能有助于對PBoV的真正認識和有效防控。相信通過科研人員今后更多的研究，我們會得到更多PBoV的相關(guān)知識。

［1］湯賽冬，孫泉云，顧永遠.豬博卡病毒感染的研究進展［J］.國外畜牧學(xué)：豬與禽，2012，32（1）：80－81.

［2］Allander T，Tammi M T，Eriksson M，et al.Cloning of a human parvovirus by molecular screening of respiratory tract samples［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102：12891－12896.

［3］Allander T.Human bocavirus［J］.J Clin Virol，2008，41：29－33.

［4］Blomstrm A L，Belak S，F(xiàn)ossum C，et al.Detection of a novel porcine boca－like virus in the background of porcine circovirus type 2induced postweaning multisystemic wasting syndrome［J］.Virus Res，2009，146（1－2）：125－129.

［5］Manteufel J，Truyen U.Animal bocaviruses：a brief review［J］.Int Virol，2008，51：328－334.

［6］Zeng S L，Wang D，F(xiàn)ang L R，et al.Complete coding sequences and phylogenetic analysis of porcine bocavirus（PBoV）［J］.J Gen Virol，2011，10：1099.

［7］Zhai S L，Yue C，Wei Z Z，et al.High prevalence of a novel porcine bocavirus in weanling piglets with respiratory tract symptoms in China［J］.Arch Virol，2010，155（8）：1313－1317.

［8］Zeng S，Wang D，F(xiàn)ang L，et al.Complete coding sequences and phylogenetic analysis of porcine bocavirus［J］.J Gen Virol，2011，92（Pt 4）：784－788.

［9］翟少倫，陳勝男，魏文康.豬博卡病毒的研究進展［J］.病毒學(xué)報，2012，28（2）：190－193.

［10］Blomstrm A L，Belak S，F(xiàn)ossum C，et al.Studies of porcine circovirus type 2，porcine boca－like virus and torque teno virus indicate the presence of multiple viral infections in postweaning multisystemic wasting syndrome pigs［J］.Virus Res，2010，152（1－2）：59－64.

［11］翟少倫，岳 城，韋祖樟，等.豬博卡病毒PCR檢測方法的建立及其應(yīng)用［J］.中國動物傳染病學(xué)報，2010，18（2）：14－17.

［12］McKillen J，McNeilly F，Duffy C，et al.Isolation in cell cultures and initial characterization of two novel bocavirus species from swine in Northern Ireland［J］.Vet Microbiol，2011，152（1－2）：39－45.

［13］Cadar D，Cságola A，Lorincz M，et al.Genetic detection and analysis of porcine bocavirus type 1（PoBoV1）in European wild boar（Susscrofa）［J］.Virus Genes，2011，43（3）：376－379.

［14］Zhang H B，Huang L，Liu Y J，et al.Porcine bocaviruses：genetic analysis and prevalence in Chinese swine population［J］.Epidemiol Infect，2011，139（10）：1581－1586.

［15］Lau S K，Woo P C，Yip C C，et al.Co－existence of multiple strains of two novel porcine bocaviruses in the same pig，a previously undescribed phenomenon in members of the family Parvoviridae，and evidence for inter－and intra－h(huán)ost genetic diversity and recombination［J］.J Gen Virol，2011，92（Pt 9）：2047－2059.

［16］李 彬，何孔旺，溫立斌，等.一種檢測豬博卡病毒的PCR方法［P］.中國專利：201110063365.2011－09－07.

［17］Li B，Xiao S，Ma J，et al.Development of a novelTaqManbased real－time PCR assay for the detection of porcine bocalike virus（Pbo－likeV）［J］.Virol J，2011，8（1）：357.

［18］黃 律，龍進學(xué)，翟少倫，等.豬細小病毒4型Taq Man熒光定量PCR方法的建立與應(yīng)用［J］.動物醫(yī)學(xué)進展，2011，32（1）：1－9.

［19］李 彬，毛 立，何孔旺，等.豬博卡病毒NP1基因的克隆與原核表達［J］.華北農(nóng)學(xué)報，2011，26（3）：28－31.

［20］李 彬，何孔旺，溫立斌，等.豬博卡病毒的LAMP檢測試劑盒及其檢測方法［P］.中國專利：201110092345.2011－04－13.