豬圓環(huán)病毒2型疫苗研究進(jìn)展

徐 磊，寧蓬勃，郭抗抗，董 平，董福軍，張彥明＊

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌712100；2.靖邊縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，陜西靖邊718500）

豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus，PCV）于1974年首次在豬腎（porcine kidney，PK）細(xì)胞系中被發(fā)現(xiàn)［1］。PCV為圓環(huán)病毒科的成員，是動(dòng)物病毒中最小的病毒，能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中自主復(fù)制。病毒粒子為二十面體，無(wú)囊膜，直徑17 nm。PCV有2種基因型，PCV－1在世界范圍的豬群內(nèi)廣泛存在，被認(rèn)為對(duì)豬沒(méi)有致病性，不會(huì)引起豬的任何臨床疾??；PCV－2于20世紀(jì)90年代發(fā)現(xiàn)于加拿大，是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰弱綜合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）的病原體，并可以引起多種豬圓環(huán)病毒相關(guān)性疾?。≒orcine circovirus－associated diseases，PCVADs），主要侵害對(duì)象為斷奶仔豬和育肥豬。

PCV的基因組是大小1.7 kb的單鏈環(huán)狀DNA分子，包含ORF1和ORF2兩個(gè)主要的閱讀框（open reading frame，ORF）。ORF1稱(chēng)為 Rep基因，編碼由314（PCV－1）、312（PCV－2）個(gè)氨基酸組成、大小為35.7 ku的蛋白質(zhì)，與病毒復(fù)制有關(guān)；ORF2稱(chēng)為cap基因，編碼由233個(gè)氨基酸組成、大小為27.8 ku的衣殼蛋白，是病毒主要的免疫原性蛋白，與PCV－2特異性中和抗體產(chǎn)生密切相關(guān)，是研制針對(duì)PCV－2新一代疫苗的研究熱點(diǎn)。除了ORF1和ORF2，有研究發(fā)現(xiàn)ORF3表達(dá)的蛋白雖然不是病毒在細(xì)胞中復(fù)制時(shí)所必須的，但與病毒引發(fā)細(xì)胞凋亡，從而使機(jī)體發(fā)病有關(guān)［2］。

在世界上養(yǎng)豬業(yè)比較發(fā)達(dá)的國(guó)家，PCV－2被認(rèn)為是給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)?yè)p失最多的病原體之一。美國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)建議使用“豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病”（Porcine circovirus－associated disease，PCVAD）這個(gè)涵蓋性術(shù)語(yǔ)來(lái)描述與PCV－2感染有關(guān)的疾病綜合征，其主要癥狀包括消瘦，死亡率增加，呼吸道癥狀，腸炎，繁殖失敗，豬皮炎腎病綜合征（Porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS），但是還沒(méi)有試驗(yàn)證據(jù)顯示PCV－2感染和PDNS的發(fā)生直接相關(guān)。在歐洲，文獻(xiàn)中使用豬圓環(huán)病毒?。≒orcine circovirus disease，PCVD）的表述更為常見(jiàn)。在試驗(yàn)條件下，豬單獨(dú)感染PCV－2并不會(huì)引起嚴(yán)重的PCVAD臨床癥狀，只有與豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）、豬細(xì)小病毒（Porcine parvovirus，PPV）、豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopnemoniae，Mhyo）其中的一個(gè)或多個(gè)混合感染才能誘導(dǎo)產(chǎn)生明顯的PCVAD臨床癥狀。但是，PCV－2單獨(dú)感染剖腹產(chǎn)－不吃初乳（Caesarean－derived，colostrum－de－prived，CD／CD）豬或者無(wú)菌豬，可以導(dǎo)致嚴(yán)重的PCVAD 臨床癥狀［3］。

近年來(lái)至少鑒別出了3種有明顯區(qū)別的PCV－2基因 型，PCV－2a、PCV－2b 和 PCV－2c。PCV－2a和PCV－2b都不同程度的與PCVAD的發(fā)生相關(guān)；PCV－2c僅在丹麥的一些無(wú)臨床癥狀的豬群中有過(guò)報(bào)道［4］。2003年以前，歐洲和中國(guó)都出現(xiàn)過(guò)PCV－2a和PCV－2b，美國(guó)和加拿大只出現(xiàn)過(guò)PCV－2a。自2003年以來(lái)，伴隨著PCVAD臨床癥狀越來(lái)越嚴(yán)重，商品化豬群中的優(yōu)勢(shì)亞型逐漸變成了PCV－2b。PCV－2a和PCV－2b序列上的差異主要存在于cap基因上，包括一個(gè)“特征性氨基酸模體”區(qū)域［5］。盡管還沒(méi)有識(shí)別PCV－2a和PCV－2b的抗原結(jié)構(gòu)，但目前基于PCV－2a的疫苗都能夠提供針對(duì)PCV－2b的交叉保護(hù)。就針對(duì)田間PCV－2b野毒株的保護(hù)力來(lái)說(shuō)，現(xiàn)在還不確定基于PCV－2b的新型疫苗是否能夠提供比目前基于PCV－2a的疫苗更高的保護(hù)力。在此，我們將討論目前市面上商業(yè)化疫苗的效果和一些新型實(shí)驗(yàn)性疫苗的研究進(jìn)展。

1 商品化疫苗

1.1 現(xiàn)有的商品化疫苗

2004年，第一個(gè)商品化的PCV－2疫苗在法國(guó)和德國(guó)面世。目前市場(chǎng)上用于預(yù)防豬群中PCVAD發(fā)生的商品化疫苗一共有5種，其分別是Merial生產(chǎn)的 Circovac HT5SS?，Boehringer Ingelheim 生產(chǎn)的Ingelvac CircoFLEX?，Intervet（Merck）生產(chǎn)的Circumvent?，Schering－Plough（Merck）生 產(chǎn) 的 Porcilis?PCV，Pfizer生產(chǎn)的 FosteraTMPCV（Suvaxyn?PCV－2 One Dose?升級(jí)版），這些都是基于PCV－2a基因型的生產(chǎn)的。

Circovac?（Merial）是用滅活的 PCV－2a病毒生產(chǎn)而成的，可以用于免疫大于3周齡的健康仔豬，也可以用于免疫健康經(jīng)產(chǎn)母豬。用Circovac?免疫仔豬一般需要一次肌肉內(nèi)注射，免疫后備母豬或者經(jīng)產(chǎn)母豬一般需要在交配前3周～4周免疫2次，分娩前2周～4周加強(qiáng)免疫1次。

Ingelvac CircoFLEX?（Boehringer Ingelheim），Circumvent?（Intervet／Merck），和 Porcilis?PCV（Schering－Plough／Merck）都是基于桿狀病毒中表達(dá)的PCV－2a Cap蛋白生產(chǎn)的亞單位疫苗，也已經(jīng)在市場(chǎng)上銷(xiāo)售，都可用于免疫大于3周齡的健康仔豬。這種疫苗是將PCV－2基因組中編碼Cap蛋白的片段克隆到昆蟲(chóng)桿狀病毒中，通過(guò)培養(yǎng)昆蟲(chóng)桿狀病毒，快速、大量獲得具備免疫原性的PCV－2Cap蛋白，再將其制成疫苗。大量田間試驗(yàn)表明，該類(lèi)疫苗可為仔豬提供良好的免疫保護(hù)。

FosteraTMPCV （Pfizer Animal Health Inc.）最近也已經(jīng)進(jìn)入市場(chǎng)，它是Suvaxyn?PCV－2 One DoseTM（Fort Dodge Animal Health Inc.）的升級(jí)版。FosteraTMPCV疫苗是滅活的減毒嵌合病毒，其是將PCV－2a的cap基因克隆入無(wú)致病性PCV－1基因組骨架中。用FosteraTMPCV免疫大于3周齡的仔豬需只要一次肌肉內(nèi)注射，就能預(yù)防PCV－2感染和其引起的毒血癥。

1.2 現(xiàn)有商品化疫苗的免疫效果

在對(duì)照攻毒試驗(yàn)中，市售PCV－2疫苗的效果已得到了廣泛的檢驗(yàn)。由于普通豬單獨(dú)感染PCV－2產(chǎn)生的臨床癥狀有限，大多數(shù)研究疫苗免疫效果采用的攻毒模型是用幾種豬病原體混合感染。使用混合感染模型攻毒的優(yōu)點(diǎn)在于其更接近野外條件下的真實(shí)感染情況，現(xiàn)已經(jīng)知道有多種豬病原體能夠在混合感染后加劇PCVAD的臨床癥狀，例如與PRRSV的混合感染能夠加劇豬感染PCV－2，從而導(dǎo)致PCV－2在口鼻分泌液和排泄物中的含量增加。

用Suvaxyn?PCV－2 One Dose?免疫豬，免疫接種后（postvaccination，dpv）28 d后就有中和抗體產(chǎn)生。用PCV－2和PRRSV聯(lián)合攻毒，與未免疫組相比，免疫組肺臟損傷、排泄物排毒、血清中PCV－2含量降低、淋巴損傷顯著減少。有研究在不同動(dòng)物模型上攻毒，比較 Suvaxyn?PCV－2 One Dose?，Circumvent?，CircoFLEX?的免疫效果，發(fā)現(xiàn)每一種疫苗都能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體。與未免疫的組相比，免疫組在 PCV－2、豬流感病毒（Swine influenza virus，SIV）和PRRSV聯(lián)合攻毒后血清中PCV－2病毒含量降低、淋巴損傷減少［6］。PCV－2 免疫時(shí)，PRRSV的感染狀況并沒(méi)有影響免疫效果，免疫已有PCV－2毒血癥的豬則能降低 PCV－2、PRRSV、PPV聯(lián)合攻毒后的PCV－2毒血癥和淋巴組織中PCV－2含量［7］。用Suvaxyn?PCV－2 One Dose?來(lái)免疫公豬后，以PCV－2和MHYO聯(lián)合攻毒，與未免疫豬相比，免疫豬血液中PCV－2含量減少，排泄物與精液中病毒排出量降低，從而可以預(yù)防嚴(yán)重臨床癥狀的發(fā)生［8］。 用 Suvaxyn?PCV－2 One Dose?或 者 CircoFLEX?免疫豬，與未免疫的豬相比，免疫豬血清中病毒含量降低，淋巴損傷減少，增重提高。

很多研究都是在對(duì)照試驗(yàn)條件下研究疫苗免疫效果的，其都證明了這些商品化疫苗在對(duì)抗PCV－2感染時(shí)的良好效果。在普通豬上使用能夠復(fù)制PCVAD臨床癥狀的混合感染模型，證明免疫接種能夠有效的降低PCV－2復(fù)制到系統(tǒng)水平的能力。所以說(shuō)，即使豬群在復(fù)雜外界條件下可能暴露于各種感染性的豬病原體，使用市售疫苗而產(chǎn)生的保護(hù)性免疫可以很好的保護(hù)豬群。

2 實(shí)驗(yàn)性疫苗

現(xiàn)在市面上的商品化PCV－2疫苗都是基于PCV－2a基因型的且效果確實(shí)，但是現(xiàn)在世界范圍內(nèi)豬群PCV－2的主要流行亞型是PCV－2b基因型。盡管亞單位和滅活苗有其穩(wěn)定和安全的優(yōu)點(diǎn)，但是一些新的疫苗技術(shù)已經(jīng)被用于誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)PCV－2的免疫反應(yīng)，從而預(yù)防PCV－2感染。與滅活苗或亞單位苗相比，改良減毒活疫苗（modified live－attenuated vaccines，MLV）能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)；DNA疫苗和其他一些載體疫苗亦具有將PCV－2抗原遞呈給宿主的能力，具有發(fā)展為新型疫苗的巨大潛力。

2.1 改良減毒活疫苗

一般來(lái)說(shuō)，改良減毒活疫苗能同時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)，與現(xiàn)在的亞單位苗或滅活苗相比，能產(chǎn)生更好的保護(hù)力。有報(bào)道稱(chēng)，在細(xì)胞上連續(xù)傳代使PCV－2野型減毒的方法是可行的，PCV－2在PK－15細(xì)胞上傳代120次之后，cap基因的兩個(gè)核苷酸發(fā)生了突變。傳代120次的病毒（P120）包含了cap基因上P110A和R191S的突變，這種突變能夠提高PCV－2在體外的生長(zhǎng)能力，但又使其在體內(nèi)是減毒的，說(shuō)明P120是MLV很有潛力的候選毒株［9］。但是這種策略的缺點(diǎn)在于MLV有恢復(fù)到致病性表型的可能性，并最終可能導(dǎo)致豬發(fā)病。

研制嵌合疫苗是一種更合理更安全的方法。盡管主要的表型不同，無(wú)致病性的PCV－1和與PCVAD相關(guān)的PCV－2是遺傳學(xué)上非常接近的病毒，有著相似的基因組結(jié)構(gòu)，而且有報(bào)道顯示PCV－1和PCV－2的復(fù)制基因（rep）是可以互換的。有人將PCV－2a型的ORF2克隆到缺失ORF2的PCV－1型的骨架中，獲得PCV1－2a重組嵌合病毒，這種嵌合病毒是減毒的但具有感染性［10］。用滅活的PCV1－2a免疫豬后，對(duì)免疫豬群用PCV－2a野毒攻毒，結(jié)果表明滅活的PCV1－2a嵌合病毒能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)PCV－2a的保護(hù)性免疫應(yīng)答［9］。還有其他研究表明活的嵌合病毒也是減毒的，具有免疫原性且遺傳特性穩(wěn)定，能夠提供與現(xiàn)在市售的滅活苗和亞單位苗相似的針對(duì) PCV－2a和PCV－2b的保護(hù)力［7］。另一種制備嵌合病毒的方法是將PCV－2b的ORF2克隆到PCV－1骨架中。因?yàn)橐恍┝餍胁W(xué)方面的研究表明，自然感染PCV－2的豬群中流行亞型是PCV－2b，且PCV－2b的毒力似乎比PCV－2a更強(qiáng)一些，進(jìn)一步的系統(tǒng)發(fā)育評(píng)估表明，PCV－2a在進(jìn)化上比PCV－2b更加古老，從PCV－2a到PCV－2b的轉(zhuǎn)變與PMWS的發(fā)生密切相關(guān)［4］。而現(xiàn)在市場(chǎng)上的商品化疫苗都是基于PCV－2a研制而成的滅活疫苗或重組疫苗。因此，也有人用PCV－2b的ORF2替換PCV－1的ORF2，包裝出了一種新的嵌合病毒。這種嵌合病毒在動(dòng)物體內(nèi)是減毒的，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)，并且可以產(chǎn)生對(duì)PCV－2a的交叉保護(hù)，可以作為一種改良減毒活病毒疫苗［3］。在另一項(xiàng)研究中，用 嵌 合 PCV1－2b免疫豬后，以 PCV－2b、PRRSV、PPV三重感染模型聯(lián)合攻毒，顯示豬得到了良好保護(hù)［11］。嵌合的PCV1－2b病毒可以在豬群中正常接觸時(shí)傳播但依舊保持其減毒的特性，說(shuō)明PCV1－2b的復(fù)制并沒(méi)有在PRRSV出現(xiàn)時(shí)變化。

將嵌合PCV1－2a和PCV1－2b作為改良減毒活疫苗的研究表明，嵌合PCV1－2a和PCV1－2b病毒是減毒的，能夠在普通豬上誘導(dǎo)廣泛的保護(hù)性免疫應(yīng)答，作為一種改良活減毒疫苗具有很大的潛力。與通過(guò)連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)傳代來(lái)使PCV－2野型減毒的傳統(tǒng)方法不同，嵌合PCV1－2病毒從根本上消除了人們對(duì)于MLV毒力返強(qiáng)的擔(dān)心。雖然現(xiàn)在市面上的PCV－2疫苗十分有效，但是在豬群中使用更安全的改良活減毒疫苗不但可以降低免疫成本，而且能同時(shí)誘導(dǎo)針對(duì)PCV－2的細(xì)胞免疫和體液免疫。

2.2 DNA疫苗

已經(jīng)有報(bào)道可以在再小鼠和豬模型上用DNA誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)，有人直接將帶有PCV－2基因組的質(zhì)粒DNA注射到豬的肝臟、淋巴結(jié)、肌肉中，可以產(chǎn)生與接種感染性病毒相同的感染。肌肉內(nèi)直接注射包含有二聚嵌合PCV1－2a基因組的質(zhì)粒DNA，也可以誘導(dǎo)豬產(chǎn)生保護(hù)性免疫［10］。因此，包含有二聚嵌合PCV1－2a基因組的質(zhì)粒DNA可以當(dāng)做MLV，以DNA的形式直接投飼給豬，使用包含有二聚嵌合PCV1－2a基因組的質(zhì)粒DNA作為MLV有一個(gè)巨大的優(yōu)勢(shì)，其就是大規(guī)模生產(chǎn)高純度的質(zhì)粒DNA相對(duì)容易，因此可以降低免疫成本。

有報(bào)道稱(chēng)，在豬和小鼠肌肉內(nèi)注射編碼PCV－2單個(gè)基因的質(zhì)粒DNA，同樣可以誘導(dǎo)針對(duì)PCV－2的免疫反應(yīng)。帶有PCV－2 cap基因的質(zhì)粒（p ORF2）可以誘導(dǎo)豬產(chǎn)生保護(hù)性免疫［12］。也有在小鼠模型上研究DNA免疫的，在小鼠上用“基因槍”投遞p ORF2產(chǎn)生了PCV－2特異性抗體的血清轉(zhuǎn)化。在小鼠模型上，在刺激產(chǎn)生PCV－2特異性中和抗體時(shí)，遞呈p ORF2比單獨(dú)遞呈Cap蛋白更加有效。與未免疫的小鼠相比，用p ORF2免疫后的小鼠能降低攻毒后淋巴結(jié)腫的PCV－2病毒含量和微觀組織損傷。亦有報(bào)道稱(chēng)，將編碼ORF1或ORF3的DNA與p ORF2同時(shí)投遞，將會(huì)干擾p ORF2單獨(dú)提供的保護(hù)性免疫［13］。有趣的是，另一個(gè)研究發(fā)現(xiàn)小鼠的DNA“基因槍”免疫方法在聯(lián)合投遞p ORF2／pORF3或p ORF1／p ORF2／p ORF3時(shí)效果最好［14］。因?yàn)楣芾碚呱系脑颍@些DNA疫苗的前景還不甚明朗。然而，美國(guó)境內(nèi)已經(jīng)批準(zhǔn)了第一個(gè)農(nóng)業(yè)部（USDA）執(zhí)照的針對(duì)馬西尼羅熱病毒（Horse West Nile virus）的DNA疫苗，打開(kāi)了未來(lái)相似疫苗進(jìn)入市場(chǎng)的大門(mén)。

2.3 載體疫苗

現(xiàn)在市售的亞單位疫苗都是基于桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的Cap蛋白的，盡管也有人探索其他生產(chǎn)和遞呈抗原的表達(dá)方法。

有人用乳酸球菌作為遞呈載體來(lái)表達(dá)PCV－2抗原蛋白（Cap蛋白）從而制備口服疫苗［15］。其將一段刪除核定位信號(hào)序列的Cap基因（d Cap）克隆到大腸埃希菌／乳酸球菌的穿梭載體pSEC：LEISS中。將細(xì)菌培養(yǎng)物通過(guò)口服途徑免疫小鼠，可以在小鼠血清中檢測(cè)到PCV－2特異性IgG抗體的顯著提高。而且不同于大腸埃希菌或桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，乳酸球菌是食用級(jí)細(xì)菌，它沒(méi)有任何致病力，非常適合用作生產(chǎn)口服疫苗。以化學(xué)方法合成帶有酵母優(yōu)化的密碼子使用序列 （yeast－optimized codon usage sequence）的cap基因（opt－cap），將其克隆到大腸埃希菌／酵母穿梭載體p YES2中?？诜曃菇湍副磉_(dá)系統(tǒng)表達(dá)的PCV－2 Cap蛋白，也能在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)抗PCV－2的抗體［16］。

有研究在λ噬菌體表面展示來(lái)源于PCV－2 cap基因的特定免疫顯性表位，在豬上免疫后可以誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)PCV－2的特異性中和抗體［17］。λ噬菌體的小衣殼蛋白D在噬菌體表面形成三聚體，與D蛋白融合的多肽能夠在大腸埃希菌質(zhì)粒中表達(dá)，且仍具可溶性。其構(gòu)建了一個(gè)共表達(dá)系統(tǒng)來(lái)展示PCV－2 Cap（CAP）蛋白的4個(gè)主要抗原區(qū)，將其展示在λ展示粒子上（lambda display particles，LDP），LDP－DCAP在對(duì)豬進(jìn)行免疫時(shí)表現(xiàn)出了良好的免疫原性，可以同時(shí)誘導(dǎo)針對(duì)PCV－2的細(xì)胞和體液免疫及中和抗體的產(chǎn)生。且在不添加佐劑的條件下，用LDPD－CAP蛋白來(lái)免疫豬，即可得到較強(qiáng)免疫效果。

桿狀病毒作為一種新興的具有吸引力的哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因遞呈載體，近年來(lái)越來(lái)越受到人們的重視。有人用帶有水皰性口炎糖蛋白（VSV－G）的假型桿狀病毒作為載體來(lái)表達(dá)Cap蛋白，其受到巨細(xì)胞病毒立即早期（CMV－IE）增強(qiáng)子／啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄水平的控制［18］。得到的重組桿狀病毒（BV－G－OFR2）能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞上高效的轉(zhuǎn)入和表達(dá)蛋白。直接用1×108或者1×109pfu／每鼠的BV－G－OFR2免疫小鼠，能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高的PCV－2特異性的中和抗體和細(xì)胞免疫反應(yīng)。即使在1×108pfu／鼠的劑量下，與DNA疫苗相比，BV－G－OFR2表現(xiàn)出了更好的免疫原性。BV－G－OFR2既有較高的免疫原性，又有假型桿狀病毒的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，包括易于操作、擴(kuò)大培養(yǎng)簡(jiǎn)單、無(wú)毒性、宿主無(wú)預(yù)先存在的針對(duì)桿狀病毒的抗體。

偽狂犬病也是一種重要的豬病，經(jīng)常與圓環(huán)病毒合并感染。有報(bào)道稱(chēng)用偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）作為活病毒疫苗載體的研究工作中取得突破性進(jìn)展［19］，為研制抗豬圓環(huán)2型和偽狂犬病毒感染的二價(jià)疫苗提供了可能。有人構(gòu)建了能表達(dá)Cap蛋白的重組PRV，能夠誘導(dǎo)豬產(chǎn)生針對(duì)PCV－2和PRV的體液免疫反應(yīng)［20］。其方法是將豬圓環(huán)2型病毒ORF2基因插入pIECMV質(zhì)粒，并與偽狂犬病病毒 Tk－／g E－／LacZ＋共轉(zhuǎn)染至IBRS－2細(xì)胞系中，產(chǎn)生 Tk－／gE－／ORF2＋重組病毒。以重組病毒免疫接種4周齡的仔豬后，仔豬獲得了很高的針對(duì)PCV－2和PRV的體液免疫。另一組研究人員將PCV ORF1和部分ORF2基因片段經(jīng)插入到轉(zhuǎn)移載體內(nèi)，重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至IBRS－2細(xì)胞中，得到能表達(dá)PCV ORF1－ORF2融合蛋白的PRV，其在細(xì)胞中的生長(zhǎng)特性和原載體病毒類(lèi)似。在Balb／c小鼠和豬體的動(dòng)物試驗(yàn)中，通過(guò)PRV中和試驗(yàn)、針對(duì)PCV－2的ELISA檢測(cè)和PCV－2特異性淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)驗(yàn)證了PRV－PCV－2重組病毒可以誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的抗PRV和抗PCV－2抗體；并在致死性PRV／Ea株的攻毒試驗(yàn)中有著較好的保護(hù)效果，這項(xiàng)研究與另一項(xiàng)研究結(jié)果一致［20］。但是由于一些國(guó)家的RPV凈化計(jì)劃，還不能確定PRV載體能否用于豬群免疫。

與其他表達(dá)載體相比，腺病毒（Adenovirus）載體具有許多優(yōu)點(diǎn)，例如：①基因結(jié)構(gòu)與功能清晰；②能感染多種細(xì)胞和組織；③復(fù)制迅速，能夠產(chǎn)生高滴度的病毒；④不插入染色體，不會(huì)引起插入突變；⑤有較強(qiáng)被外源基因插入的能力。因此，在重要的人類(lèi)和動(dòng)物疾病方面，腺病毒已廣泛應(yīng)用于基因疫苗和基因治療中。γ干擾素（interferon gamma，IFN－γ）是一種由激活的CD4＋、CD8＋T淋巴細(xì)胞和自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子。IFN－γ具有抗病毒活性和佐劑樣效果的雙重作用，具有顯著的免疫調(diào)節(jié)活性。而且有很多研究證實(shí)，包含細(xì)胞因子和保護(hù)性抗原的融合基因通常具有協(xié)同效應(yīng)，與單獨(dú)的抗原相比，能夠誘導(dǎo)更佳的免疫反應(yīng)。因此，有人構(gòu)建了能夠編碼PCV－2Cap蛋白和豬IFN－γ的重組腺病毒，命名為r Ad－ORF2－IFN－γ［21］。將其轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞后能夠收集到滴度高達(dá)109.899TCID50／mL的病毒。這種重組病毒能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生較高的PCV－2特異性中和抗體?？贵w水平比單獨(dú)r Ad－ORF2或單獨(dú)者腺病毒誘導(dǎo)的都高。以PCV－2攻毒后，與未免疫豬相比，免疫豬有更高的增重和較低的淋巴結(jié)微觀病變與毒血癥發(fā)病率。

也有研究采用大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)，引入密碼子優(yōu)化的cap基因，表達(dá)并純化得到PCV－2 Cap蛋白［22］。用優(yōu)化的大腸埃希菌密碼子來(lái)替代ORF2 5＇端的精氨酸密碼子后，克服了原核表達(dá)系統(tǒng)病毒蛋白表達(dá)量過(guò)低的問(wèn)題。每升細(xì)菌培養(yǎng)物的蛋白產(chǎn)量可達(dá)10 mg，采用單陽(yáng)離子交換層析法純化后可得到均一度超過(guò)95%的蛋白。盡管大腸埃希菌表達(dá)的Cap蛋白不能自我組裝成病毒樣顆粒（virus－like particles，VLPs），但用重組Cap蛋白免疫小鼠后產(chǎn)生的特異性抗體與自然感染PCV－2病毒后產(chǎn)生的相同。

以桿菌屬的減毒菌株支氣管炎博德特菌（Bordetella bronchiseptica）為載體可以表達(dá)PCV－2 Cap蛋白，經(jīng)滴鼻途徑免疫小鼠和豬后，采用ELISA方法可在被免疫的動(dòng)物血清中檢測(cè)到特異性抗體。用構(gòu)建的活苗免疫豬，以PCV－2進(jìn)行攻毒，免疫豬淋巴結(jié)內(nèi)PCV－2含量顯著降低，從而達(dá)到了用活疫苗免疫來(lái)預(yù)防PCV－2感染的目的［23］。雖然研究人員在以細(xì)菌為載體的PCV－2基因工程疫苗領(lǐng)域進(jìn)行了很多探索和嘗試，但目前尚沒(méi)有這方面的PCV－2疫苗在市場(chǎng)上銷(xiāo)售。

總之，活載體疫苗能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生很強(qiáng)的針對(duì)PCV－2的免疫反應(yīng)，而不會(huì)有PCV－2感染的風(fēng)險(xiǎn)。然而人們對(duì)活載體疫苗的使用還是有些擔(dān)心，首先是使用的載體其免疫原性也許會(huì)干擾針對(duì)PCV－2的免疫；其次是在田間使用活載體疫苗的過(guò)程中活疫苗載體毒力可能會(huì)返強(qiáng)。

2.4 標(biāo)記疫苗

由于豬群中PCV－2感染的廣泛存在，發(fā)展一種能夠區(qū)別自然感染和免疫產(chǎn)生抗體的方法就顯得尤其重要。用具有新型抗原表位的疫苗免疫豬后，可用血清學(xué)方法將免疫豬和自然感染豬區(qū)分開(kāi)來(lái)。最近，有報(bào)道稱(chēng)研發(fā)了一種ELISA方法（Bacucheck－TM，Intervet／Schering Plough／Merck），可以來(lái)用來(lái)確認(rèn) Porcilis PCV （Schering－Plough／Merck）免疫后豬的免疫狀態(tài)。這種ELISA方法能夠檢測(cè)到Porcilis PCV疫苗免疫后出現(xiàn)的針對(duì)baculomarkers的抗體（baculomarkers是疫苗中Cap蛋白的一個(gè)特征性標(biāo)記），從而證明豬體內(nèi)的抗體是來(lái)源于免疫還是自然感染［24］。然而，還沒(méi)有其他的類(lèi)似產(chǎn)品來(lái)證明其他市售疫苗的免疫狀態(tài)。

表達(dá)具有感染性的PCV－2和嵌合PCV1－2b表面的新穎抗原表位，是生產(chǎn)標(biāo)記疫苗的新途徑。有報(bào)道稱(chēng)PCV－2基因組cap基因的C端至少容許插入27個(gè)氨基酸，而且插入后的氨基酸剛好是暴露在病毒粒子表面。減毒活嵌合PCV1－2a病毒能展示短抗原表位標(biāo)簽，從而誘導(dǎo)感染豬產(chǎn)生抗PCV－2抗體和抗表位標(biāo)簽抗體，從而給后續(xù)的特異性抗體檢測(cè)帶來(lái)便利［25］。這項(xiàng)研究隨后被另一個(gè)試驗(yàn)證實(shí)，其成功在PCV－2cap基因的C端插入11個(gè)氨基酸標(biāo)簽后，病毒在小鼠模型上具有感染性和免疫原性［26］。因此，減毒的帶抗原表位標(biāo)簽的PCV－2或嵌合PCV1－2，可以作為一種優(yōu)秀的標(biāo)記MLV，能夠給追蹤豬群中疫苗毒的傳播帶來(lái)便利。

3 展望

現(xiàn)在市面上的所有PCV－2疫苗都能有效的降低PCV－2感染農(nóng)場(chǎng)中臨床疾病的發(fā)生，提高豬群生產(chǎn)指數(shù)。雖然疫苗免疫接種并不能夠完全防止PCV－2的感染和傳播，但是能夠極大的降低毒血癥、系統(tǒng)水平的病毒含量和病毒的外排，從而降低環(huán)境中的病毒含量?？紤]到豬病原體的混合感染給豬群健康和生產(chǎn)指數(shù)帶來(lái)的影響，對(duì)豬進(jìn)行免疫從而最大限度的減少其他健康豬群暴露于PCV－2是很重要的。

盡管現(xiàn)在市面上的疫苗都是基于PCV－2a基因型的且具有較好的免疫效果，但下一代的疫苗應(yīng)該是基于PCV－2b基因型的，由于目前PCV－2主要的流行亞型已經(jīng)逐漸變成PCV－2b。已經(jīng)有證據(jù)顯示，在豬群中可以自然發(fā)生PCV－2不同亞型的混合感染，并且已經(jīng)發(fā)生了PCV－2a和PCV－2b的重組體的感染［27］?；赑CV－2b的新型疫苗技術(shù)，包括標(biāo)記疫苗和安全的改良減毒活疫苗，能夠在提高細(xì)胞免疫和體液免疫的同時(shí)降低PCV－2免疫成本。

分子生物學(xué)的飛速發(fā)展為改良減毒活疫苗、DNA疫苗、載體疫苗、標(biāo)記疫苗這樣的新型疫苗的發(fā)展提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和豐富的材料。但是需要強(qiáng)調(diào)的是，研發(fā)一個(gè)成功而實(shí)用的疫苗，并不是僅僅依據(jù)基因工程原理和分子生物學(xué)理論即可完成的，還必須考慮到病毒的病原特性、疾病的發(fā)病機(jī)理、動(dòng)物的免疫保護(hù)機(jī)制以及病毒感染的流行病學(xué)特點(diǎn)。相信隨著研究的深入，最終將會(huì)研發(fā)出更加安全高效的疫苗，從而控制PCV－2的流行，減少養(yǎng)豬業(yè)的損失。

［1］Tischer I，Gelderblom H，Vettermann W，et al.A very small porcine virus with circular single－stranded DNA［J］.Nature，1982，295：64－66.

［2］Liu J，Chen I，Du Q，et al.The ORF3 protein of porcine circovirus type 2 is involved in viral pathogenesis in vivo［J］.J Virol，2006，80（10）：5065－5073.

［3］Beach N M，Ramamoorthy S，Opriessnig T，et al.Novel chimeric porcine circovirus（PCV）with the capsid gene of the emerging PCV2b subtype cloned in the genomic backbone of the non－pathogenic PCV1 is attenuated in vivo and induces protective and cross－protective immunity against PCV2b and PCV2a subtypes in pigs［J］.Vaccine，2010，29（2）：221－232.

［4］Dupont K，Nielsen E，Baekbo P，et al.Genomic analysis of PCV2 isolates from Danish archives and a current PMWS casecontrol study supports a shift in genotypes with time［J］.Vet Microbiol，2008，128（1－2）：56－64.

［5］Cheung A，Lager K，Kohutyuk O，et al.Detection of two porcine circovirus type 2 genotypic groups in United States swine herds［J］.Archi Virol，2007，152（5）：1035－1044.

［6］Opriessnig T，Patterson A，Madson D，et al.Comparison of efficacy of commercial one dose and two dose PCV2 vaccines using a mixed PRRSV－PCV2－SIV clinical infection model 2－3－months post vaccination［J］.Vaccine，2009，27（7）：1002－1007.

［7］Shen H，Beach N，Huang Y，et al.Comparison of commercial and experimental porcine circovirus type 2（PCV2）vaccines using a triple challenge with PCV2，porcine reproductive and respiratory syndrome virus （PRRSV），and porcine parvovirus（PPV）［J］.Vaccine，2010，28（37）：5960－5966.

［8］Opriessnig T，Madson D，Schalk S，et al.Porcine circovirus type 2（PCV2）vaccination is effective in reducing disease and PCV2 shedding in semen of boars concurrently infected with PCV2 and Mycoplasma hyopneumoniae［J］.Theriogenology，2011，76 （4）：351－360.

［9］Fenaux M，Opriessnig T，Halbur P，et al.Two amino acid mutations in the capsid protein of type 2 porcine circovirus（PCV2）enhanced PCV2 replication in vitro and attenuated the virus in vivo［J］.J Virol，2004，78（24）：13440－13446.

［10］Fenaux M，Opriessnig T，Halbur P，et al.A chimeric porcine circovirus（PCV）with the immunogenic capsid gene of the pathogenic PCV type 2（PCV2）cloned into the genomic backbone of the nonpathogenic PCV1 induces protective immunity against PCV2 infection in pigs［J］.J Virol，2004，78（12）：6297－6303.

［11］Opriessnig T，Shen H，Pal N，et al.A live－attenuated chimeric porcine circovirus type 2 （PCV2）vaccine is transmitted to contact pigs but is not upregulated by concurrent infection with porcine parvovirus（PPV）and porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）and is efficacious in a PCV2b－PRRSV－PPV challenge model［J］.Clin Vac Immunol，2011，18（8）：1261－1268.

［12］Blanchard P，Mahe D，Cariolet R，et al.Protection of swine against post－weaning multisystemic wasting syndrome （PMWS）by porcine circovirus type 2（PCV2）proteins［J］.Vaccine，2003，21（31）：4565－4575.

［13］Shen H G，Zhou J Y，Zhang X，et al.Interference of porcine circovirus type 2 ORF2 immunogenicity by ORF1 and ORF3 mixed DNA immunizations in mice［J］.Virology，2009，393（1）：104－111.

［14］Aravindaram K，Kuo T Y，Lan C W，et al.Protective immunity against porcine circovirus 2 in mice induced by a gene－based combination vaccination［J］.J Gene Medicine，2009，11（4）：288－301.

［15］Wang K，Huang L，Kong J，et al.Expression of the capsid protein of porcine circovirus type 2 in Lactococcus lactis for oral vaccination［J］.J Virol Methods，2008，150（1）：1－6.

［16］Bucarey S A，Noriega J，Reyes P，et al.The optimized capsid gene of porcine circovirus type 2 expressed in yeast forms virus－like particles and elicits antibody responses in mice fed with recombinant yeast extracts［J］.Vaccine，2009，27（42）：5781－5790.

［17］Opriessnig T，Madson D，Prickett J，et al.Effect of porcine circovirus type 2（PCV2）vaccination on porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）and PCV2 coinfection［J］.Vet Microbiol，2008，131（1）：103－114.

［18］Fan H，Pan Y，F(xiàn)ang L，et al.Construction and immunogenicity of recombinant pseudotype baculovirus expressing the capsid protein of porcine circovirus type 2 in mice［J］.J Virol Methods，2008，150（1）：21－26.

［19］Ju C，F(xiàn)an H，Tan Y，et al.Immunogenicity of a recombinant pseudorabies virus expressing ORF1－ORF2 fusion protein of porcine circovirus type 2［J］.Vet Microbiol，2005，109（3）：179－190.

［20］Song Y，Jin M，Zhang S，et al.Generation and immunogenicity of a recombinant pseudorabies virus expressing cap protein of porcine circovirus type 2［J］.Vet Microbiol，2007，119（2）：97－104.

［21］Genmei L，Manlin L，Ruiai C，et al.Construction and immunogenicity of recombinant adenovirus expressing ORF2 of PCV2 and porcine IFN gamma［J］.Vaccine，2011，29：8677－8682.

［22］Opriessnig T，Meng X J，Halbur P G.Porcine circovirus type 2－associated disease：Update on current terminology，clinical manifestations，pathogenesis，diagnosis，and intervention strategies［J］.J Vet Diagn Invest，2007，19（6）：591.

［23］Kim T，Toan N T，Seo J，et al.Bordetella bronchiseptica aro A mutant as a live vaccine vehicle for heterologous porcine circovirus type 2 major capsid protein expression［J］.Vet Microbiol，2009，138（3－4）：318－324.

［24］Ladinig A，Von Rueden S，Ritzmann S，et al.Use of the new Bacucheck TM ELISA to differentiate between PCV2－vaccinated and unvaccinated pigs of different ages［C］.In Proceedings of International Symposium on Emerging and Re－emerging Pig Diseases，Barcelona Spain，2011.

［25］Beach N M，Smith S M，Ramamoorthy S，et al.Chimeric porcine circoviruses（PCV）containing amino acid epitope tags in the C terminus of the capsid gene are infectious and elicit both anti－epitope tag antibodies and anti－PCV type 2 neutralizing antibodies in pigs［J］.J Virol，2011，85（9）：4591－4595.

［26］Huang L，Lu Y，Wei Y，et al.Construction and biological characterisation of recombinant porcine circovirus type 2 expressing the V5 epitope tag［J］.Virus Res，2011，161（2）：115.

［27］Gagnon C A，Music N，F(xiàn)ontaine G，et al.Emergence of a new type of porcine circovirus in swine（PCV）：A type 1 and type 2 PCV recombinant［J］.Vet Microbiol，2010，144（1－2）：18－23.