豬鏈球菌2型毒力因子研究進展

吳立志，王金良，肖躍強，李書光，祖立闖，伍曉雄，沈志強＊

（1．華中農業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖北武漢430070；2．山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州256600）

豬鏈球菌2型毒力因子研究進展

吳立志1，2，王金良2，肖躍強2，李書光2，祖立闖2，伍曉雄1＊，沈志強2＊

（1．華中農業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖北武漢430070；2．山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州256600）

豬鏈球菌2型（SS2）是一種重要的人獸共患病病原菌，其主要毒力因子包括莢膜多糖、溶菌酶釋放蛋白、溶血素、纖連蛋白結合蛋白、谷氨酸脫氫酶等，但是這些經典的毒力因子不足以解釋豬鏈球菌病發(fā)病的臨床癥狀，而且毒力表型往往與實際毒力及臨床癥狀不符。近年來隨著研究的深入，鑒定出一系列毒力相關元件，主要有Sao蛋白、存在于89K毒力島的雙信號轉導系統(tǒng)（salk－sal R）、dlt A基因、pgd A基因、srt A基因、Ⅳ型二肽基肽酶（dipeptidyl peptidaseⅣ，DPPⅣ）、毒力調控子R（control of virulence R，Cov R）、烯醇酶（enolase）、谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，Gln A）等。論文對以上毒力因子研究進展進行綜述，以期為SS2毒力因子及致病機制研究提供參考。

豬鏈球菌2型；毒力因子；致病機制

豬鏈球菌2型（Streptococcussuisserotype 2，SS2）是重要的人獸共患病病原。1998年和2005年分別在我國江蘇省和四川省暴發(fā)了人感染豬鏈球菌2型的疫情，患者表現(xiàn)出中毒性休克綜合癥（STSS）、敗血癥、腦膜炎甚至死亡等嚴重的臨床癥狀［1］。豬鏈球菌是豬的常在菌群，屬于條件致病菌，雖然對多種抗生素敏感（尤其是四環(huán)素），但是抗生素在豬場長期性預防應用時易造成多種病菌耐藥性的增強［2］，并且SS2多呈與其他病原混合感染或者繼發(fā)感染，對我國養(yǎng)豬業(yè)造成重大損失。疫苗免疫是控制疫病的關鍵措施之一，為了研制高效的疫苗，近些年國內外對SS2進行了系統(tǒng)的病原學、流行病學、病理學、免疫學相關研究，尤其是毒力因子及致病機理的研究取得了一定的研究進展，表現(xiàn)在對經典毒力因子致病機理的進一步闡明和新的毒力相關元件的發(fā)現(xiàn)。本文就SS2致病性毒力因子的研究做一綜述，以期對SS2疫苗的開發(fā)研究提供參考。

1 已知的毒力因子

1．1 莢膜多糖

莢膜多糖（capsular polysaccharide，CPS）作為SS2的毒力因子最先由Smith H E等［3］報道，他們的研究鑒定了11個開放閱讀框，其產物參與CPS的合成，采用插入誘變的方法獲得兩個無CPS的SS2突變株，進行豬感染試驗發(fā)現(xiàn)突變株對肺泡巨噬細胞極其敏感，容易被吞噬，說明CPS在SS2抵抗免疫細胞吞噬過程發(fā)揮作用；而且無莢膜突變株接種SPF乳豬不能引起任何癥狀，說明CPS是重要的黏附因子。但是，不同SS2菌株的CPS成分會有差異，在制備過程中難獲得穩(wěn)定結構的CPS，而且多糖屬于非胸腺依賴性抗原，其免疫原性差，作為疫苗效果并不理想。

1．2 溶菌酶釋放蛋白和胞外因子

對溶菌酶釋放蛋白（muramidase－released protein，MRP）和胞外因子（extracellular factor，EF）的研究說明SS2毒力具有菌株的差異。通過對致病菌株和無毒株MRP、EF表型進行統(tǒng)計學分析表明，MRP和EF與SS2致病性相關［4］；MRP可黏附上皮細胞，并可誘導上皮細胞凋亡，確證了 MRP是SS2的毒力因子；EF存在于某些菌株培養(yǎng)物上清中，其氨基酸序列呈現(xiàn)多態(tài)性。將基因工程蛋白MRP及EF免疫豬，可以獲得抵抗SS2感染的保護力。MRP與A群鏈球菌的主要毒力因子M蛋白具有同源性，是亞單位疫苗的候選分子之一。

1．3 溶血素

溶血素（suilysin，Sly）在SS2指數(shù)增長后期產生，屬于硫醇激活的穿孔毒素家族，作用于紅細胞膜上膽固醇而溶解細胞。不同動物紅細胞對溶血素的敏感性不同，人O型紅細胞最敏感，馬 、綿羊、牛、豬紅細胞敏感性次之，兔子最不敏感。Jacobs A A等［5］從SS2培養(yǎng)上清中純化出的Sly具有溶解紅細胞活性，用其免疫小鼠后可使小鼠獲得完全保護力。制備的Sly的抗體可以失活溶紅細胞作用，但是在感染產Sly的SS2的豬血清中不能檢測到Sly的抗體，預示著Sly在SS2感染豬的過程中破壞血液生理環(huán)境、阻抑免疫系統(tǒng)機能方面發(fā)揮重要作用，其具體機制有待進一步研究。

1．4 纖連蛋白結合蛋白

纖連蛋白結合蛋白（fibronectin binding protein，F(xiàn)BP）廣泛存在于各血清型的豬鏈球菌中，純化的FBP蛋白可以結合人纖連蛋白和纖維蛋白原，顯示了其黏附作用［6］。制備的FBP缺陷突變株與野毒株在病豬器官的分布情況表明FBP不是SS2定殖扁桃體的必要因子，但在其他器官中突變體的定殖數(shù)量明顯少于野毒株。因此，F(xiàn)BP是SS2的毒力因子，主要作用是提供黏附能力和干擾纖連蛋白正常功能。

1．5 谷氨酸脫氫酶

SS2中谷氨酸脫氫酶（glutamate dehydrogenase，GDh）以α－酮戊二酸為底物來參與菌體的能量代謝。GDh廣泛存在于各血清型豬鏈球菌菌體表面，具有很好的免疫原性，可作為保護性抗原和診斷抗原；Kutz R等［7］通過活性染色分析發(fā)現(xiàn)SS2強毒株、弱毒株與無毒株GDh活性存在差異，不同毒株的GDh存在特定的氨基酸替換，并依此建立了區(qū)分SS2不同毒力毒株的PCR檢測方法。

2 新鑒定的毒力因子

2．1 Sao蛋白

Li Y等［8］利用SS2基因表達文庫和豬感染后的恢復血清抗體庫研究發(fā)現(xiàn)了Sao蛋白，Western blot證明該蛋白存在于豬鏈球菌的絕大部分血清型中，并且利用免疫電鏡技術證明該蛋白存在于SS2表面。用兔抗Sao蛋白 血清調理吞噬試驗證明該抗體對SS2具有殺菌活性。雖然不同SS2菌株Sao蛋白具有多態(tài)性，但動物保護性試驗證明Sao蛋白對不同SS2菌株均具有良好的保護力［9］。由此可見，Sao蛋白是優(yōu)秀的蛋白亞單位疫苗候選分子，其在SS2感染過程中的作用及致病機理尚需進一步研究。

2．2 存在于89K毒力島的雙信號轉導系統(tǒng)

1998年和2005年暴發(fā)的豬鏈球菌病的病人出現(xiàn)特異性的中毒性休克綜合征，是導致人死亡的主要臨床癥狀［10］。從這些病人體內分離的SS2中發(fā)現(xiàn)89K毒力島，分子生物信息學分析發(fā)現(xiàn)該區(qū)域存在與唾液鏈球菌同源的雙信號轉導系統(tǒng)（salk－salR）雙信號轉導調節(jié)系統(tǒng)元件。Li M等［11］敲除這一元件構建了SS2突變株，仔豬感染試驗證明Sal K／SalR的存在是SS2完全毒力的必要結構；定殖試驗表明突變株SS2不能單獨定殖于任何豬的組織；殺菌試驗發(fā)現(xiàn)突變株抵抗多形核白細胞的殺傷力顯著降低；表達芯片分析發(fā)現(xiàn)突變株下調了26種基因的表達水平。以上研究充分說明89K毒力島與SS2的致病性密切相關，但其具體機制仍待進一步研究。

2．3 dlt A基因

脂磷壁酸（LTAs）是錨定于革蘭陽性細胞膜的陰離子聚合物，被認為是該類細菌的黏附因子。LTAs通常有不同程度的D－丙氨?；芑騞lt A控制。Fittipaldi N 等［12］構建了dlt A 缺失突變SS2，發(fā)現(xiàn)突變株對陽離子抗菌肽敏感性增加；與野毒株相比突變株SS2抵抗中性粒細胞的殺傷能力、黏附和入侵腦微血管內皮細胞的能力均降低，對CD1小鼠和豬的感染能力下降，這可能是由于LTAs不能D－丙氨?；沟镁w細胞膜負電荷增加引起排斥性靜電力導致細胞膜的不穩(wěn)定性，最終降低了SS2感染能力。脂磷壁酸的D－丙氨?；绊慡S2毒力的確切機制有待進一步證實。

2．4 pgd A基因

Fittipaldi N等［12］鑒定出SS2肽聚糖N端脫乙酰作用相關基因pgd A，并制備了該基因的缺失突變株SS2。體外試驗表明，pgd A基因的缺失導致SS2對溶菌酶的敏感性增加，動物感染試驗發(fā)現(xiàn)突變株毒力減弱，野毒株SS2體外與中性粒細胞共培養(yǎng)和感染小鼠過程中pgd A表達水平均上調，提示肽聚糖N端脫乙酰作用可能是SS2抵抗機體免疫系統(tǒng)的重要機制。

2．5 srt A基因

革蘭陽性細菌中，一些表面蛋白C－末端的LPXTG基序是這些蛋白定位于細胞表面的信號肽序列。Sortase A作為轉肽酶來催化肽聚糖交聯(lián)橋的甘氨酸氨基團與LPXTG基序的蘇氨酸羧基團形成酰胺鍵以達到錨定的作用。Wang C等［13］擴增了SS2的srt A基因，srt A編碼的蛋白與金黃色葡萄球菌的Sortase A蛋白同源，并且發(fā)現(xiàn)缺失srt A基因的SS2突變株毒力減弱，喪失與人細胞黏附作用。而SS2的溶菌酶釋放蛋白（MRP）和Sao蛋白是已經證明了的SS2毒力因子和黏附因子，并且含有LPXTG基序，間接說明srt A編碼的蛋白促進了細菌表面蛋白與胞壁的結合。

2．6 Ⅳ型二肽基肽酶

Ⅳ型二肽基肽酶（dipeptidyl peptidaseⅣ，DPPⅣ）最初被認為是一種T細胞活化抗原CD26，也是一種腺苷脫氨酶（ADA）結合蛋白。在哺乳動物組織中廣泛表達?？梢匝杆偾姨禺愋缘亓呀怆逆淣末端第二位的脯氨酸或丙氨酸殘基，其配體多種多樣，參與機體的能量代謝、物質代謝、免疫系統(tǒng)活動。Ge J等［14］首次報道了SS2 DPPⅣ同源物，測定其具有酶活性，并且可以結合人纖連蛋白，構建的DPPⅣ缺失株SS2對動物感染能力下降。但DPPⅣ發(fā)揮作用的具體機制仍待進一步研究。

2．7 毒力調控子

二元信號轉導系統(tǒng)（two component signal transduction systerm，TCSTS）作為致病菌中遍存在的一種信號轉導機制，在調節(jié)毒力基因表達和構成細菌致病性等方面發(fā)揮著重要作用。毒力調控子R（control of virulence R，CovR）是A群、B群、C群以及變形鏈球菌中普遍存在的重要的反應調節(jié)因子，調控眾多細菌毒力相關基因的轉錄表達［15－16］。Pan X等［17］在SS2中發(fā)現(xiàn)獨立存在的Cov R，并建立了CovR缺失株，試驗證明缺失株與上皮細胞的黏附能力、抵抗中性粒細胞和單核細胞的吞噬與殺傷能力、對組織的定殖能力大大加強；轉錄譜分析發(fā)現(xiàn)Cov R的存在不同程度抑制了195個基因的轉錄，其中包括一些已經證明的毒力因子。因此，Cov R被認為是SS2毒力因子的全局調控子。

2．8 烯醇酶

烯醇酶（enolase）能夠催化2－磷酸－甘油酸失水而生成磷酸烯醇丙酮酸，參與糖酵解過程。Esgleas M等［18］證明具有酶活性的烯醇酶存在于SS2，并且其可結合于人纖連蛋白；免疫電鏡觀察到烯醇酶存在于SS2表面，是SS2的黏附因子。Zhang A等［19］原核表達了SS2烯醇酶重組蛋白，該重組蛋白對小鼠具有免疫保護力；實時定量PCR監(jiān)測發(fā)現(xiàn)烯醇酶為體內誘導表達抗原。因此，烯醇酶為SS2毒力因子，可能為保護性抗原，具有蛋白亞單位疫苗開發(fā)價值。

2．9 次黃嘌呤單磷酸脫氫酶

Zhang X H等［20］鑒定出了SS2合成次黃嘌呤單磷酸脫氫酶（IMPDH）的基因impdh，并將其原核表達純化出具有酶活性的IMPDH。構建的impdh缺失突變株生長極其緩慢，對小鼠和豬進行多次攻毒未能致死。IMPDH是嘌呤合成途徑限速酶，影響菌體的增殖。由此可見，IMPDH為SS2完全毒力所需，可能是因為其影響整個菌體的核酸代謝，其中包括毒力相關因子的編碼基因和細菌增殖所必需的基因組復制。這對于發(fā)現(xiàn)SS2關鍵毒力因子也許沒有太大意義，但為我們提供了防治豬鏈球菌病另外的思路——抑制菌體的基礎代謝率可以消除菌體對動物機體的高致病力。

2．10 谷氨酰胺合成酶

谷氨酸與游離分子氨在谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，Gln A）的作用下生成谷氨酰胺，這個反應是可逆的。對于氨基酸的分解代謝與合成代謝有非常積極的意義。Si Y等［21］缺失掉合成SS2 Gln A的基因gln A制備了突變株，細胞黏附試驗表明突變株對上皮細胞的黏附能力大大降低；小鼠攻毒試驗說明gln A缺失突變株為弱毒株。Gln A影響的是菌體氨基酸代謝，突變株毒力減弱可能是因為蛋白質類毒力因子的產生受到影響，而其毒力沒有完全喪失提示SS2毒力可能還有非蛋白質類因子的參與。

3 結語

綜上所述，對SS2毒力因子的研究已經有了很多，并且對這些毒力因子的作用機制也有了初步認識，但仍然不能形成區(qū)分SS2強毒株與弱毒株的標準。需要特別說明的是，目前非常流行基因缺失或突變法研究基因對SS2毒力的貢獻或影響［22－24］，這種方法鑒定出的基因元件可能并非SS2毒力因子，因為很多基因參與SS2的基礎代謝，缺失之后會影響SS2的生長，以至于造成毒力降低或者消失的假象。但是這種方法卻提供了控制豬鏈球菌病另外的途徑——通過突變或缺失基因獲得可用作疫苗的弱毒株。

目前越來越多的學者認為SS2的毒力是多種毒力因子協(xié)同作用的結果，因為SS2感染人或者豬后導致了幾種典型的臨床癥狀，如腦膜炎、中毒性休克等?，F(xiàn)在尚缺乏可靠的針對SS2引起各種特異癥狀的動物模型，以至于始終不能確定引起各特征癥狀的超級抗原，也無從真正了解其發(fā)病機制。豬鏈球菌的其他方面研究也尚未明朗，如豬鏈球菌是豬體常在菌群，定殖于豬扁桃體，是什么引起豬鏈球菌病的暴發(fā)？從非致病到致病狀態(tài)轉化的原因，可能是SS2非毒力株或弱毒株向強毒株的轉化，也可能是豬體狀態(tài)的變化（如免疫力下降），還可能是雙方協(xié)同變化的結果？目前的研究主要關注SS2毒力因子及其致病機理，寄希望于建立區(qū)分不同毒力株的標準，尚不能徹底解決豬鏈球菌病的威脅。因此，今后SS2致病因子的研究可能會更加關注與豬體的相互作用，尤其是豬體自身的變化，相信在不久的將來關于豬鏈球菌暴發(fā)因素的研究會有更進一步進展。

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Advance in Virulence Factors ofStreptococcus suisSerotype 2

WU Li－zhi1，2，WANG Jin－liang2，XIAO Yue－qiang2，LI Shu－guang2，ZU Li－chuang2，WU Xiao－xiong1，SHEN Zhi－qiang2

（1．CollegeofVeterinaryMedicineinHuazhongAgriculturalUniversity，Wuhan，Hubei，430070，China；2．ShandongBinzhouAnimalScienceAndVeterinaryMedicineInstitute，Binzhou，Shandong，256600，China）

Streptococcussuistype 2（SS2）is an important pathogenic bacterium which can cause amphixenosis，whose primary virulence factors include capsular polysaccharide（CPS），muramidase－released protein（MRP），suilysin（Sly），fibronectin binding protein（FBP），glutamate dehydrogenase（GDH）et．，but the clinical symptoms caused by SS2 did not correspond with the virulence phenotype．With the development of research，some new virulence components have been identified，include the follows：protein Sao，the twocomponent signal transduction system（salk－sal R）exist in the 89k pathogenicity island，the dlt A gene，the srt A gene，dipeptidyl peptidase IV（DPP IV），control of virulence R（Cov R），enolase，glutamine synthetase（Gln A）et．This article focused these virulence factors and their nosogenesis in SS2 infection．

Streptococcussuisserotype 2；virulence factor；pathogenesis

S852．4

A

1007－5038（2012）06－0118－05

2012－02－25

吳立志（1986－ ），男，安徽池州人，碩士，主要從事動物生理生化與分子免疫學研究。＊通訊作者

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