HPLC-ELSD法測(cè)定酸羊奶中水蘇糖含量

宋娟娜， 陳 合， 王長(zhǎng)鳳， 舒國(guó)偉

(陜西科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 710021)

0 引 言

水蘇糖(stachyose)是自然界存在的一種功能性低聚糖，其結(jié)構(gòu)式為：D-吡喃半乳糖基α-1,6-D-吡喃半乳糖基α-1,6-D-吡喃葡糖基α-1,2-β-D-呋喃果糖苷，屬于蔗糖的衍生產(chǎn)物，是棉子糖的同系物，分子式為C24H42O21.純水蘇糖為白色粉末，甜度約為蔗糖的22%.它具有能量值低，穩(wěn)定性好等特點(diǎn)[1]；還具有增殖雙歧桿菌，調(diào)節(jié)腸道菌群，保護(hù)腸道；增強(qiáng)人的肌體免疫力，預(yù)防疾病發(fā)生；防止體內(nèi)膽固醇積蓄，降低血壓；合成B族維生素，促進(jìn)對(duì)某些無(wú)機(jī)鹽的利用等功能[2-4].因此成為日本和歐洲等地流行的功能性保健食品[5].

課題組在前期研究中將不同量水蘇糖添加到羊奶中，發(fā)酵制得水蘇糖酸羊奶.本研究利用HPLC-ELSD法測(cè)定發(fā)酵后水蘇糖的含量，求水蘇糖利用率；以尋求利用率低，但促進(jìn)普通酸羊奶益生菌菌數(shù)增值效果好的水蘇糖添加量，為制備高品質(zhì)高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的發(fā)酵酸羊奶提供試驗(yàn)依據(jù).實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，為后期研究羊奶發(fā)酵酸奶中水蘇糖含量測(cè)定提供方法.

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀和蒸發(fā)光散射檢測(cè)器waters1525-2420；美國(guó)Waters公司：Empower2色譜工作站；水蘇糖對(duì)照品，美國(guó)sigma公司；甲醇、乙睛均為色譜純；超純水和酸羊奶樣品，實(shí)驗(yàn)室自制.

1.2 試驗(yàn)方法

(1)色譜條件 色譜柱：Hypersil NH2色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5μm)，流動(dòng)相：甲醇∶水(83∶17)，流速 1 mL/min；ELSD檢測(cè)器參數(shù)：漂移管溫度85℃，氮?dú)鈮毫?5 Psi，增益10.

(2)對(duì)照品溶液的制備 精密稱取水蘇糖對(duì)照品0.031 3 g，置于 50 mL量瓶中，加超純水溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成0.626 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液，經(jīng) 0.45μm濾膜濾過(guò)，備用.

(3)供試樣品溶液的制備 發(fā)酵制備水蘇糖添加量分別為0.4%、0.6%、0.8%和1.0%的酸羊奶，分別準(zhǔn)確量取1.5 mL制備的酸羊奶于離心管中，在高速離心機(jī)中15 000 r/min離心30 min，取出上清液繼續(xù)離心一次至上清液澄清，取1 mL上清液用超純水定容至10 mL的容量瓶中，搖勻，過(guò)0.45μm濾膜，即得4份供試樣品溶液.

(4)陰性對(duì)照溶液的制備 發(fā)酵制備不添加水蘇糖的陰性酸羊奶適量，依供試品溶液的制備法，制備陰性對(duì)照溶液.

(5)活菌數(shù)的測(cè)定 采用高層瓊脂法[6].

2 結(jié)果與討論

2.1 專屬性實(shí)驗(yàn)

在上述色譜條件下，分別取對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液、供試品溶液各20μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖.結(jié)果表明供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，有相同保留時(shí)間的色譜峰，陰性對(duì)照無(wú)干擾.水蘇糖可與酸羊奶中其它組分在10 min內(nèi)有效分離，且峰形較好.色譜圖見(jiàn)圖1～圖3.

圖1 水蘇糖供試樣品的色譜圖 圖2 水蘇糖對(duì)照品的色譜圖 圖3 陰性對(duì)照的色譜圖

2.2 線性關(guān)系考察

吸取配制好的對(duì)照品溶液4，8，12，l6，20μL，按上述色譜條件測(cè)定峰面積值，以峰面積的自然對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，以對(duì)照品溶液進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示，水蘇糖在進(jìn)樣量2.504～12.52μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其回歸方程為：y=12.204x-47.478，R2=0.999 8.

2.3 精密度試驗(yàn)

吸取對(duì)照品溶液20μL，重復(fù)進(jìn)樣 6次，測(cè)定峰面積值，計(jì)算精密度RSD為2.0%.

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取制得的同一批含水蘇糖酸羊奶，按供試樣品溶液的方法平行制備6份，均進(jìn)樣20μL，紀(jì)錄峰面積，求得6份水蘇糖濃度的RSD為1.01%.

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取上述供試品溶液0、2、4、6、8、10 h，室溫放置，各精密進(jìn)樣20μL，測(cè)定水蘇糖濃度的RSD為1.05%.結(jié)果說(shuō)明供試樣品溶液在 10 h內(nèi)穩(wěn)定.

2.6 加樣回收率試驗(yàn)

分別量取1.5 mL已知含量的酸羊奶(添加1.0%水蘇糖)9份，每3份分別精密加入上述對(duì)照品溶液4 mL、12 mL和20 mL ，即加入2.5 mg、7.5 mg和12.5 mg水蘇糖對(duì)照品；按前面供試樣品溶液的制備方法制備，進(jìn)樣20μL，測(cè)定水蘇糖峰面積計(jì)算回收率，結(jié)果顯示：平均加樣回收率為98.59%，RSD(%)為1.53%.

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.7 供試樣品測(cè)定

分別吸取4份供試樣品溶液20μL，在上述色譜條件下進(jìn)樣，每份平行測(cè)定3次，求的平均值.供試樣品的水蘇糖含量、利用率及活菌數(shù)結(jié)果見(jiàn)表2.

表2 樣品測(cè)定結(jié)果(n=3)

2.8 討論

(1)流動(dòng)相選擇： 通過(guò)實(shí)驗(yàn)比較了幾種不同的流動(dòng)相：乙腈∶水為70∶30；甲醇∶水為70∶30；甲醇∶水為75∶35；甲醇∶水為83∶17等.結(jié)果表明，乙腈∶水體系需要的保留時(shí)間為17.5 min，且分離效果差，很難將樣品中的水蘇糖與其它成分分開(kāi)；以甲醇∶水為70∶30和甲醇∶水為75∶25為流動(dòng)相時(shí)，水蘇糖與其它成分分離效果差；以甲醇∶水為83∶17為流動(dòng)相時(shí)，分離效果最好.

(2)ELSD參數(shù)的選擇： 主要為漂移管溫度和霧化氣體壓力的選擇.漂移管溫度必須足夠高以保持溶劑霧化狀態(tài)，否則檢測(cè)器噪聲太大，但也不能過(guò)高造成樣品蒸發(fā)，導(dǎo)致靈敏度降低；另外，為保證霧化后的色譜洗脫物能夠均勻的進(jìn)入檢測(cè)池，避免大量微滴導(dǎo)致噪聲升高，因此要求保證氣體壓力足夠高.故選用漂移管溫度85 ℃，氣體壓力35 Psi，此時(shí)，噪音小，信號(hào)強(qiáng).

3 結(jié)論

選用ELSD-HPLC法測(cè)定酸羊奶中水蘇糖含量，在上述色譜條件下，水蘇糖的線性范圍為2.504～12.52μg，相關(guān)系數(shù)為0.999 8.本方法操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定，結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高、重現(xiàn)性好.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在羊奶中添加0.60%水蘇糖制備的酸羊奶，水蘇糖的利用率最小，活菌數(shù)最高，促進(jìn)益生菌生長(zhǎng)效果最好.

參考文獻(xiàn)

[1] 舒國(guó)偉，呂嘉櫪，任宏強(qiáng)，等．水蘇糖對(duì)乳制品中微生物的影響[J]．食品科學(xué)，2005，26(6)：106-108．

[2] 劉薇薇，李小偉．一種功能性化妝品原料-水蘇糖[J]．應(yīng)用科技，2008，16(13)：24-25．

[3] 任宏強(qiáng)．水蘇糖[J]．精細(xì)與專用化學(xué)品，2003, (14)：15-17．

[4] 鄧文輝．水蘇糖的功效及應(yīng)用研究概述[J]．綜述與述評(píng)，2010，13(8)：19-22．

[5] 袁其朋, 范 穎. 水蘇糖[J]. 精細(xì)與專用化學(xué)品, 2002, 10(1)：13.

[6] 熊 郃.C.B.T三種菌混合發(fā)酵益生菌酸奶發(fā)酵基本特征研究[J].乳品科學(xué)與技術(shù)，2008，(2)：56-58.