醛固酮受體拮抗劑對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響

許香梅 任曉敏 劉曙光 劉海云 王曉燕 董士民

心肌細(xì)胞凋亡是急性心肌梗死后心室重構(gòu)的重要因素，醛固酮可通過(guò)多種途徑引起細(xì)胞凋亡，參與心室重構(gòu)［1］。而細(xì)胞凋亡調(diào)控基因最受關(guān)注是Bcl-2家族，Bcl-2、Bax基因是Bcl-2家族的成員，為心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因［2］，本研究旨在評(píng)價(jià)醛固酮受體拮抗劑螺內(nèi)酯對(duì)急性心肌梗死后心肌細(xì)胞凋亡率、Bcl-2蛋白、Bax蛋白表達(dá)的影響，探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與方法 通過(guò)結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支造成大鼠左室大面積心肌梗死。將術(shù)后2 d存活的大鼠72只隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組n=24)和心肌梗死組(n=48)。心肌梗死組隨機(jī)分為:AMI對(duì)照組(AMI組，0.9%氯化鈉溶液 2 ml·d－1灌胃，n=24)和螺內(nèi)酯組(Spi組，螺內(nèi)酯 20 mg·kg－1·d－1灌胃，n=24)。3個(gè)組分別于術(shù)后的2、7、14、21 d取材，用于流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)。用3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，迅速開(kāi)胸，取出心臟，冰上操作，4℃經(jīng)高壓處理的二氧哌嗪甲酰氯(DEPC)水中洗去殘余血液，剪取左室非梗死區(qū)心肌組織約100 mg，放入75%的乙醇中保存用于流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)。

1.2 大鼠急性心肌梗死模型制作 大鼠稱(chēng)重，經(jīng)3%戊巴比妥鈉麻醉(40 mg/kg腹腔內(nèi)注射)，并給予阿托品0.1 mg/kg腹腔注射。作氣管插管，接小動(dòng)物呼吸機(jī)(由江西省特力麻醉呼吸設(shè)備公司生產(chǎn))。取前胸正中切口，在3～4肋間進(jìn)入胸腔，分離心包，從劍突下方向胸腔方向及從兩側(cè)胸壁后方向上方適度擠壓，使心臟跳出胸腔，在右室流出道與左心房之間，距主動(dòng)脈根部2～3 mm處用絲線(xiàn)(7-0)穿過(guò)左冠狀動(dòng)脈前降支，在心肌梗死組連同一小束心肌一起結(jié)扎，以心臟表面顏色即刻變化，術(shù)后心電圖J點(diǎn)抬高判斷造模成功。然后逐層關(guān)胸。撤掉呼吸機(jī)，自主呼吸平穩(wěn)后，拔出氣管插管，逐層縫合。假手術(shù)組(Sham組)只穿線(xiàn)繞過(guò)冠狀動(dòng)脈前降支而不結(jié)扎。術(shù)后大鼠保溫，單籠放置，待清醒后再次稱(chēng)重，編號(hào)，按組分籠飼養(yǎng)。

1.3 觀(guān)察指標(biāo) 流式細(xì)胞方法測(cè)定細(xì)胞凋亡率及BCL-2、Bax基因蛋白表達(dá):取以上制備好的單細(xì)胞懸液，通過(guò)間接熒光法進(jìn)行標(biāo)記。先分別加入兔抗鼠Bcl-2、Bax蛋白抗體，室溫孵育30 min，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)10 ml洗滌1次，棄去上清，加入羊抗鼠FITC-IgG二抗工作液100 μl，避光室溫孵育30 min，加入PBS 10 ml離心同上，棄上清以除去未結(jié)合的熒光二抗，上機(jī)檢測(cè)前加入PBS 0.1 ml經(jīng)500目銅網(wǎng)過(guò)濾后上機(jī)檢測(cè)。同時(shí)以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，用流式細(xì)胞儀測(cè)定樣品中Bcl-2、Bax蛋白，將采集的數(shù)據(jù)輸入計(jì)算機(jī)進(jìn)行處理，以熒光指數(shù)(fluorescence index，F(xiàn)I)表示蛋白的相對(duì)含量。FI=(樣品的平均熒光強(qiáng)度－對(duì)照樣品的平均熒光強(qiáng)度/正常組織平均熒光強(qiáng)度－對(duì)照樣品的平均熒光強(qiáng)度)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 13.3統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，多組間采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 螺內(nèi)酯對(duì)大鼠非梗死區(qū)心肌細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果:與Sham組相比較，AMI組和Spi組大鼠非梗死區(qū)心肌細(xì)胞凋亡率在2、7、14、21 d均顯著升高(P＜0.01);與 AMI組比較，Spi組大鼠非梗死區(qū)心肌細(xì)胞凋亡率14、21 d有所降低(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 3組大鼠非梗死區(qū)心肌細(xì)胞凋亡率變化n=6，%，±s

表1 3組大鼠非梗死區(qū)心肌細(xì)胞凋亡率變化n=6，%，±s

注:與 Sham 組比較，*P ＜0.01;與 AMI組比較，#P ＜0.05，△P ＜0.01

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2.2 螺內(nèi)酯對(duì)大鼠非梗死區(qū)心肌細(xì)胞BCL-2、Bax蛋白表達(dá)的影響 與Sham組相比較，AMI組大鼠非梗死區(qū)心肌細(xì)胞BCL-2蛋白表達(dá)在2、7、14、21 d 均顯著降低(P＜0.01)，Bax蛋白表達(dá)在2、7、14、21 d 均顯著升高(P＜0.01);與 AMI組比較，Spi組大鼠非梗死區(qū)心肌細(xì)胞BCL-2蛋白表達(dá)在2、7 d差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，14、21 d均有所升高差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);Bax蛋白表達(dá)在2、7 d差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，14、21 d 均有所降低(P＜0.05)。見(jiàn)表2、3。

表2 3組大鼠非梗死區(qū)心肌細(xì)胞BCL-2蛋白表達(dá)n=6，±s

表2 3組大鼠非梗死區(qū)心肌細(xì)胞BCL-2蛋白表達(dá)n=6，±s

注:與假手術(shù)組比較，*P ＜0.05，#P ＜0.01;與 AMI組比較，△P ＜0.05，☆P ＜0.01

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表3大鼠非梗死區(qū)心肌細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)n=6，±s

表3大鼠非梗死區(qū)心肌細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)n=6，±s

注:與假手術(shù)組比較，*P ＜0.01;與 AMI組比較，#P ＜0.05，△P ＜0.01

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3 討論

急性心肌梗死后心肌細(xì)胞凋亡在梗死區(qū)和非梗死區(qū)均存在，是急性心肌梗死后心室重構(gòu)的重要因素［2，3］。細(xì)胞凋亡是受多種基因調(diào)控的程序性死亡，為凋亡信號(hào)通路的啟動(dòng)和相關(guān)基因的表達(dá)，其中Bcl-2基因家族的作用尤為重要。其中重要成員Bcl-2基因目前被認(rèn)為是最重要的抑制細(xì)胞凋亡的基因。在急性心肌梗死后非梗死區(qū)Bcl-2蛋白表達(dá)明顯下降同時(shí)Bax蛋白表達(dá)明顯升高，從而增加心肌細(xì)胞凋亡［4］。

本實(shí)驗(yàn)顯示:大鼠急性心肌梗死后在A(yíng)MI組2、7、14、21 d心肌細(xì)胞凋亡率顯著升高，而非梗死區(qū)Bcl-2蛋白表達(dá)均明顯降低，與研究報(bào)道［3］一致。提示AMI后心肌細(xì)胞凋亡與其Bcl-2蛋白表達(dá)呈相反趨勢(shì)，Bcl-2蛋白的表達(dá)抑制AMI后心肌細(xì)胞凋亡。一般認(rèn)為Bcl-2蛋白可以和Bax蛋白結(jié)合，形成異源二聚體終止凋亡［5］。Bcl-2蛋白還可通過(guò)改變細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的Ca2+流而抑制凋亡［6］。Bax蛋白的表達(dá)在大鼠心肌梗死后AMI組 48 h、7 d、14 d、21 d 表達(dá)明顯增加，這與文獻(xiàn)［7，8］一致，提示Bax蛋白的高表達(dá)可以促進(jìn)心肌細(xì)胞的凋亡。Bax基因是Bcl-2家族的另一重要成員，與Bcl-2作用相反，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。有實(shí)驗(yàn)表明冠心病猝死者心肌細(xì)胞凋亡數(shù)與其Bax蛋白表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)呈明顯正相關(guān)［9］。Bax基因可能是通過(guò)下調(diào)Bcl-2基因，升高細(xì)胞內(nèi)Ca2+誘發(fā)細(xì)胞凋亡［10］。

本實(shí)驗(yàn)顯示:Spi組對(duì)大鼠急性心肌梗死非梗死區(qū)心肌細(xì)胞BCL-2蛋白表達(dá)隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高，分別升高6.3%、17%;心肌細(xì)胞凋亡率及Bax蛋白表達(dá)逐漸降低。提示螺內(nèi)酯可能通過(guò)增加Bcl-2蛋白表達(dá)，減弱Bax蛋白表達(dá)，提高Bcl-2/Bax蛋白比率，而抑制心肌細(xì)胞凋亡，改善急性心肌梗死后心室重構(gòu)。目前研究顯示引起細(xì)胞凋亡機(jī)制，可能與炎性細(xì)胞的激活、氧化應(yīng)激損傷、Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡、細(xì)胞因子與黏附因子的表達(dá)、線(xiàn)粒體損傷有關(guān)。螺內(nèi)酯是醛固酮受體拮抗劑，其抑制心肌細(xì)胞凋亡機(jī)制可能與下列因素有關(guān):通過(guò)降低醛固酮水平，減弱相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá);通過(guò)減弱AMI后氧化應(yīng)激，減輕氧化負(fù)荷;抑制炎性介質(zhì)的表達(dá)，如TNF-α的表達(dá);影響Ca2+的內(nèi)流等機(jī)制，抑制細(xì)胞凋亡，增加Bcl-2表達(dá)，減弱Bax的表達(dá)，達(dá)到改善心室重構(gòu)的作用。

急性心肌梗死后，非梗死區(qū)心肌細(xì)胞凋亡及Bax蛋白的表達(dá)增加，Bcl-2蛋白的表達(dá)降低;螺內(nèi)酯治療可增加大鼠急性心肌梗死非梗死區(qū)Bcl-2蛋白的表達(dá)和減弱細(xì)胞凋亡及Bax蛋白的表達(dá)。

1 馮其茂，楊祖福.心肌細(xì)胞壞死和凋亡與心肌梗死后心室重構(gòu).中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐，2007，13:59-60.

2 Akyurek LM，Johnsson C，Lange D，et al.Tolerance induction ameliorates allograft vasculopathy in rat aortictransplants.Influence of Fas-mediated apoptosis.J Clin Invest，1998，101:2889-2899.

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4 馬中富，葉任高，羅斌，等.P53和Bcl22基因mRNA在老年急性心肌梗死猝死者心肌細(xì)胞凋亡中作用的研究.中國(guó)危重病急救醫(yī)學(xué)，2001，13:593-597.

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