色素與唾液相互作用的吸附動(dòng)力學(xué)研究

李水根 姚江武，2

（1.福建醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院 修復(fù)科，福州350002；2.廈門(mén)市口腔醫(yī)院 修復(fù)科，廈門(mén)361003）

在日常生活中，茶、紅酒和食用色素是天然牙最易接觸到的著色物。茶黃素（theaflavin，TF）、姜黃素（curcumin，Cur）和矢車(chē)菊素（cyanidin，Cy）是分別來(lái)自于茶葉、姜黃和葡萄的提取物，廣泛應(yīng)用于食品添加劑中[1]。作為色源體的天然色素與人全唾液（whole saliva，WS）作用，可以沉積于牙面形成色漬，還可以與唾液蛋白結(jié)合，抑制蛋白質(zhì)的活性，使口腔黏膜產(chǎn)生干燥和皺縮感[2]。表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）技術(shù)可以將蛋白質(zhì)分子自組裝于SPR傳感器芯片表面，特別適合于研究聚合物高分子與蛋白質(zhì)之間的相互作用。本研究利用SPR技術(shù)，將WS自組裝于芯片表面，考察色素TF、Cur和Cy吸附于WS表面的動(dòng)態(tài)全過(guò)程，分析色素與WS蛋白質(zhì)分子之間的相互作用和親合力，探討物體表面著色物形成和干燥及皺縮感產(chǎn)生的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

SR7000DC型SPR儀（Reichert公司，美國(guó)）、Biofuge Fresco型低溫離心機(jī)（Heraeus公司，德國(guó)）、Millipore Direct-Q3超純水器（Millipore公司，法國(guó)）。高純度的TF、Cur和Cy，二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（日本西寶生物科技有限公司）。11-巰基十一烷酸（11-mercaptoundecanoic acid，11-MUA），1、3-二甲基氨基丙基-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽[1-ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl）carbodiimide hydrochloride，EDC]，N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS），牛血清白蛋白，緩沖液（phosphate buffer solution，PBST）；上述試劑均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 WS的收集和蛋白質(zhì)量濃度的測(cè)定 收集WS的具體步驟詳見(jiàn)參考文獻(xiàn)[3]。收集完成后采用Bradford法測(cè)定WS蛋白的質(zhì)量濃度，測(cè)定步驟詳見(jiàn)參考文獻(xiàn)[4]。

1.2.2 自組裝WS膜 SPR芯片置于60 ℃的10 mmol·L-111-MUA/純乙醇溶液中24 h，取出后用純乙醇沖洗，氮?dú)獯蹈伞Ｍㄈ? mL的體積比為1∶1的0.2 mol·L-1EDC和0.1 mol·L-1NHS的混合溶液，活化SPR芯片10 min，然后注入1 mL的WS溶液至吸附達(dá)到穩(wěn)態(tài)，再注入1 mol·L-1pH8.5的乙醇胺鹽酸溶液1 mL，維持10 min，形成WS自組裝單分子膜（self-assembled monolayer，SAM）[5]。

1.2.3 SPR動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè) 在25 ℃條件下，將色素溶解于pH值為6.8的DMSO中，并以10 mmol·L-1PBST稀釋成不同濃度（0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mmol·L-1）的溶液，以5 μL·min-1的流速分別注入芯片，30 min后色素吸附達(dá)到穩(wěn)態(tài)。實(shí)時(shí)記錄傳感圖譜。

1.2.4 吸附動(dòng)力學(xué)公式 本研究選擇兩個(gè)吸附動(dòng)力學(xué)公式，Langmuir公式[6]和Freundlich公式[7]，二者分別為C/M=1/KLMm+C/Mm和logM=logKf+1/n logC。式中C是被吸附溶液的濃度；M是吸附量；KL是Langmuir吸附常數(shù)，反映吸附過(guò)程的強(qiáng)度；Mm為飽和狀態(tài)的最大吸附量；1/n是常數(shù)；Kf是Freundlich吸附常數(shù)，意義同KL。以C/M對(duì)C和logM對(duì)logC作圖，求得直線的斜率和截距，進(jìn)而求得吸附等溫線常數(shù)：KL、Mm和Kf。

SPR芯片上配體與分析物反應(yīng)的速率公式[8]：dR/dt=kaCRmax-（kaC+kd）R。上式中C為分析物的濃度，Rmax為芯片上形成最多復(fù)合物時(shí)所得到的響應(yīng)，R為在時(shí)間t時(shí)所得到的響應(yīng)。以dR/dt對(duì)R作圖可得到一條直線，其斜率為表觀吸附常數(shù)Kobs，且Kobs=-（kaC+kd）。以-Kobs對(duì)C作圖，同樣可以得到一條直線，斜率即為結(jié)合速率常數(shù)ka，截距為解離速率常數(shù)kd。結(jié)合平衡常數(shù)KA=ka/kd，解離平衡常數(shù)KD=kd/ka[9]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)Langmuir和Freundlich吸附等溫線的相關(guān)決定系數(shù)（R2）進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)；采用單因素方差分析比較不同色素對(duì)WS的吸附動(dòng)力學(xué)常數(shù)總體均數(shù)之間的差異，SNK-q檢驗(yàn)用于均數(shù)間的兩兩比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 WS蛋白的質(zhì)量濃度

采用Bradford法測(cè)定WS蛋白的質(zhì)量濃度的平均值為1.043 g·L-1。

2.2 吸附模型R2的比較

圖1為在25 ℃、pH值為6.8、10 mmol·L-1PBST的緩沖體系下，不同濃度的3種色素吸附于WS表面達(dá)到穩(wěn)態(tài)后所記錄的響應(yīng)強(qiáng)度與時(shí)間的關(guān)系曲線。伴隨著色素濃度的增大，響應(yīng)值不斷增大，提示吸附量不斷增多。圖2表示色素吸附于WS表面的Langmuir和Freundlich等溫線和表觀吸附常數(shù)Kobs與色素濃度的關(guān)系曲線。Langmuir模型下R2值為：TF為0.920 0±0.040 3、Cur為0.926 8±0.037 0、Cy為0.980 3±0.003 0；Freundlich模型下R2值為：TF為0.983 1±0.010 6、Cur為0.994 7±0.003 9、Cy為0.997 7±0.019 0。配對(duì)t檢驗(yàn)結(jié)果為：兩種模型下，TF、Cur和Cy的R2值之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 不同濃度的色素對(duì)WS生物膜表面吸附的響應(yīng)強(qiáng)度與時(shí)間的關(guān)系曲線Fig 1 The curves of response versus time for the interactions of pigments with WS at various pigment concentrations

圖2 色素吸附于WS表面的動(dòng)力學(xué)曲線Fig 2 The kinetic curves for pigments adsorption onto WS surface

2.3 吸附動(dòng)力學(xué)常數(shù)的比較

根據(jù)圖2及吸附動(dòng)力學(xué)公式求得常數(shù)KL、Mm和Kf及其統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果見(jiàn)表1。方差分析結(jié)果表明：KL值之間的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示采用Langmuir模型采集的3種色素的吸附強(qiáng)度值相同；采用兩種模型采集的Mm和Kf值之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），即TF＞Cur＞Cy。

表1 3種色素的吸附動(dòng)力學(xué)常數(shù)KL、 Mm和Kf的比較Tab 1 Comparison of adsorption kinetic constants KL,Mm and Kf for three kinds of pigments

2.4 速率常數(shù)和平衡常數(shù)的比較

速率常數(shù)和平衡常數(shù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2：結(jié)合速率常數(shù)ka和結(jié)合平衡常數(shù)KA，其結(jié)果均為T(mén)F＞Cur＞Cy（P＜0.05），解離速率常數(shù)kd和解離平衡常數(shù)KD則是Cy＞Cur＞TF（P＜0.05），表明反應(yīng)速率的變化趨勢(shì)與Freundlich模型采集的吸附強(qiáng)度和親和力趨勢(shì)一致。

表2 3種色素吸附于WS表面的速率常數(shù)和平衡常數(shù)的比較Tab 2 Comparison of constants of rate and equilibrium for three kinds of pigments

3 討論

3.1 唾液SAM

SAM是分子通過(guò)化學(xué)鍵相互作用自發(fā)吸附在固/液或氣/液界面，形成熱力學(xué)穩(wěn)定、能量最低的有序膜。在本實(shí)驗(yàn)中，11-MUA末端的羧基在以EDC為催化劑的條件下與NHS反應(yīng)，轉(zhuǎn)換為N-羥基琥珀酰亞胺酯，從而與唾液蛋白分子中的氨基反應(yīng)形成共價(jià)鍵結(jié)合，將蛋白質(zhì)固定在固體表面。

3.2 吸附模型

本實(shí)驗(yàn)中色素對(duì)WS膜的Langmuir和Freundlich等溫式的相關(guān)決定系數(shù)R2的配對(duì)t檢驗(yàn)表明，F(xiàn)reundlich模型的R2值均大于Langmuir模型的R2值，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示Freundlich模型更適合于描述本實(shí)驗(yàn)的吸附反應(yīng)。同時(shí)Langmuir模型的3種色素的吸附常數(shù)值（KL）相同，而Freundlich模型的吸附常數(shù)值（Kf）不相同，進(jìn)一步表明吸附過(guò)程采用經(jīng)驗(yàn)的Freundlich模型描述更為準(zhǔn)確。

3.3 親和力

由表1可知，F(xiàn)reundlich模型中反映相互作用的親和力的動(dòng)力學(xué)常數(shù)Kf值為T(mén)F＞Cur＞Cy，這表明茶黃素與唾液的親和力最強(qiáng)，姜黃素次之，矢車(chē)菊素最小。速率常數(shù)和平衡常數(shù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明：茶黃素吸附于唾液表面的速度最快，且達(dá)到平衡狀態(tài)的時(shí)間最短，姜黃素次之，矢車(chē)菊素最慢。色素吸附于唾液表面的親和力的結(jié)果與吸附等溫式的線性相關(guān)分析結(jié)果一致。在本研究中的3種酚式色素的分子結(jié)構(gòu)中，茶黃素芳香環(huán)上有9個(gè)-OH，姜黃素有3個(gè)-OH和2個(gè)甲氧基，矢車(chē)菊素有5個(gè)-OH。理論上甲氧基比-OH具有更強(qiáng)的極性，能夠在蛋白質(zhì)分子與酚式色素間形成羰氫鍵連接，進(jìn)而具有親核加成能力[10]。由于姜黃素芳香環(huán)上的甲氧基的極性比矢車(chē)菊素分子結(jié)構(gòu)中-OH的略大，因此，姜黃素的穩(wěn)定性和生物活性強(qiáng)于矢車(chē)菊素，最終導(dǎo)致其在吸附反應(yīng)中對(duì)唾液蛋白質(zhì)的親和力大于矢車(chē)菊素。當(dāng)色素吸附于唾液蛋白質(zhì)分子的表面時(shí)，由于存在質(zhì)子轉(zhuǎn)移，酚式色素上的-OH與唾液蛋白分子上的H+結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生氫鍵結(jié)合[11]。綜上所述，茶黃素芳香環(huán)上的-OH最多，故而生物活性最強(qiáng)，姜黃素次之，矢車(chē)菊素最弱。由此可見(jiàn)，酚式色素的生物活性隨著其分子結(jié)構(gòu)中羥基數(shù)量的增加而加強(qiáng)，這一結(jié)論與以往的研究結(jié)果相一致[12]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)人唾液與色素之間的相互作用的動(dòng)力學(xué)研究，建立了唾液和色素生物膜的體外分子模型，將色素吸附于唾液表面的研究深入到分子水平。動(dòng)力學(xué)研究表明：唾液蛋白與色素之間的作用驅(qū)動(dòng)力源自氫鍵反應(yīng)。該模型的建立將有助于對(duì)牙著色機(jī)制進(jìn)行深入研究，為預(yù)防牙著色的形成和改善牙的美觀以及了解口腔黏膜表面產(chǎn)生干燥和皺縮感的生理學(xué)機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。今后尚需在此動(dòng)力學(xué)研究的基礎(chǔ)上，考察不同的生理?xiàng)l件（溫度、pH值和離子強(qiáng)度）下，色素對(duì)唾液蛋白構(gòu)象和生化特性的影響。

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