應(yīng)用細胞片層技術(shù)構(gòu)建組織工程骨修復(fù)犬下頜骨缺損的實驗研究

姚超 卜令學 王科 李寧毅 王玲玲 于躍遠

（青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院 口腔頜面外科，青島266003）

組織工程的迅速興起為頜骨缺損的修復(fù)提供了新的方法和思路。組織工程必須具備種子細胞、支架與生長因子[1]。通常將種子細胞植入多孔支架材料中，但普通用胰酶消化的細胞的Na+/K+-ATP酶、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白-1（glucose transporter-1，GLUT-1）、鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運載體-1（sodium glucose cotransporter-1，SGLT-1）、水通道蛋白等被破壞丟失，不利于其在支架上黏附、分泌細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）形成骨組織結(jié)構(gòu)[2]。另外在植入過程中容易造成種子細胞丟失。筆者應(yīng)用細胞片層技術(shù)獲取種子細胞，既保留了細胞間的結(jié)構(gòu)，又保留了細胞分泌的ECM，減少了種子細胞的喪失[3]。本實驗在復(fù)合血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（recombinant human bone morphogenetic protein-2，rhBMP-2）的聚乳酸羥基乙酸共聚物[poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA]支架材料中加入骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow stem cells，BMSCs）細胞懸液，并在其表面包裹犬BMSCs細胞片層，然后植入犬的下頜骨缺損處，以期構(gòu)建具有一定正常骨結(jié)構(gòu)和功能的組織工程骨，為下頜骨缺損探討更好的修復(fù)方法。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器設(shè)備

PLGA支架（山東省醫(yī)療器械研究所），DMEM培養(yǎng)液（Gibco公司，美國），rhBMP-2（Peprotech公司，美國），VEGF（Prospec公司，以色列），溫度反應(yīng)性培養(yǎng)皿（Nunc公司，丹麥），倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本），JSM-840掃描電子顯微鏡（JEOL公司，日本）。

1.2 實驗動物

選取由青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院實驗動物中心提供的健康雜種犬16只為研究對象，12～14個月齡，體重18～23 kg，雌雄不限。由青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院實驗動物中心在相同條件下飼養(yǎng)。

1.3 方法

1.3.1 BMSCs的獲取、分離和培養(yǎng) 將實驗犬麻醉后抽取骨髓血10 mL，密度梯度離心法分離BMSCs。將BMSCs用培養(yǎng)液稀釋到密度為每毫升1×107個后，接種到50 mL培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡下觀察，達到80%匯合狀態(tài)時，采用0.25%胰蛋白酶（含0.02%乙二胺四乙酸）消化，以1∶2比例傳代。

1.3.2 BMSCs成骨誘導(dǎo) 將傳代培養(yǎng)的第二代細胞加入6 mL含10%胎牛血清、成骨誘導(dǎo)液[4]（50 mg·L-1維生素C、10 mmol·L-1β-甘油磷酸鈉、1×10-4mmol·L-1地塞米松）的DMEM高糖培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中，將BMSCs向成骨細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)。

1.3.3 BMSCs細胞片層的制備 采用胰蛋白酶消化經(jīng)成骨誘導(dǎo)的BMSCs，在細胞計數(shù)后以每毫升1×107個的密度接種到溫度反應(yīng)性培養(yǎng)皿中，放置于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中，每3 d換液。10 d后BMSCs鋪滿培養(yǎng)皿底部，然后將培養(yǎng)皿放入20 ℃恒溫箱中30 min，BMSCs與溫度反應(yīng)性培養(yǎng)皿底部分離形成細胞片層。

1.3.4 PLGA支架制備 將PLGA支架修整為上底長3 cm、寬1 cm；下底長2.5 cm、寬1 cm；高1 cm的多邊體，并在背側(cè)做一30 mm×3 mm×5 mm凹槽，以備嵌入下牙槽神經(jīng)血管束。利用冷凍真空干燥法將0.1 μg·mL-1rhBMP-2和5 μg·mL-1VEGF復(fù)合到PLGA支架中，低溫消毒后，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 BMSCs接種和細胞片層包裹支架 將誘導(dǎo)后的BMSCs用0.25%胰酶消化，加入培養(yǎng)液終止消化后，1 000 r·min-1離心5 min，調(diào)整細胞密度，以細胞密度為每毫升1×107個植入到PLGA支架中，使支架完全浸濕，分為A、B組。A組在支架表面包裹2層BMSCs細胞片層，作為實驗組；B組不包裹BMSCs細胞片層，作為對照組。置于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，取部分掃描電鏡觀察。

1.3.6 動物體內(nèi)植入 將16只犬分為4組，每組4只，靜脈麻醉成功后，在兩側(cè)下頜骨體下緣各做5 cm切口，切開皮膚、筋膜及肌肉，暴露下頜骨體，在兩側(cè)下頜骨體中部各做一與支架相對應(yīng)的上寬下窄全層梯形缺損，以防植入體脫出，注意保留下牙槽神經(jīng)血管束。左側(cè)（實驗側(cè)）植入支架A，右側(cè)（對照側(cè)）植入支架B。將下頜神經(jīng)血管束嵌入支架凹槽中，嚴密縫合軟組織，對支架進一步固定。術(shù)后每只實驗犬每天肌注青霉素400萬U，持續(xù)7 d。

1.3.7 大體觀察、影像學檢查和組織學檢查 術(shù)后4、8、12、16周分別處死1組實驗動物，取出雙側(cè)下頜骨作大體觀察。在同樣投照條件下（電壓：51 kV，電流：4.13 mA，時間：0.04 s，投照距離：1 m）拍攝標本X線片，用image pro plus 6.0軟件分析測量光密度值。實驗側(cè)與對照側(cè)在相同部位分別切取部分標本組織，常規(guī)脫礦，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，制作組織切片，倒置相差顯微鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，對不同組同一時間點光密度值采用配對t檢驗，對同一組不同時間點光密度值采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 細胞培養(yǎng)

BMSCs接種后4 h可觀察到少量細胞貼壁；接種后24 h，細胞呈不規(guī)則三角形。接種后10 d，細胞達到100%匯合狀態(tài)，并呈長梭形或旋渦狀排列（圖1）。向成骨方向誘導(dǎo)后，細胞逐漸變圓，排列緊密，部分細胞重疊（圖2）。

2.2 BMSCs細胞片層收獲

將誘導(dǎo)后的BMSCs接種到溫度反應(yīng)性培養(yǎng)皿中，7～10 d后可見細胞鋪滿培養(yǎng)皿底部，細胞排列緊密，部分區(qū)域可見細胞層疊現(xiàn)象。將培養(yǎng)皿放置20 ℃環(huán)境中60 min，可見貼壁細胞從培養(yǎng)皿邊緣處開始脫離，逐漸收縮，最終整個從培養(yǎng)皿底部脫離形成完整的細胞片層（圖3）。

圖1 原代培養(yǎng)的BMSCs呈長梭形或旋渦狀排列 HE×100Fig 1 The primary cultured BMSCs were arranged in fusiform or swirling HE×100

圖2 成骨誘導(dǎo)后的BMSCs細胞逐漸變圓，排列緊密HE×100Fig 2 BMSCs were changed to oblong and tightly arranged after differentiated into osteoblasts HE×100

圖3 細胞片層與培養(yǎng)皿底部分離，懸浮于培養(yǎng)液中Fig 3 The cell sheet completely separated from the petri dish and floated in the culture solution

2.3 BMSCs細胞片層復(fù)合PLGA支架掃描電鏡觀察

電鏡下觀察PLGA支架呈多孔網(wǎng)狀三維立體結(jié)構(gòu)，孔徑為100～300 μm。BMSCs植入及細胞片層包裹支架后3 d，可見細胞伸出多個偽足黏附在支架材料表面及孔隙中（圖4）。細胞片層及分泌的細胞外基質(zhì)覆蓋于支架表面（圖5）。

2.4 大體觀察結(jié)果

16只犬全部成活并進入結(jié)果分析。術(shù)后4周，支架材料被軟組織包繞，可見明顯支架結(jié)構(gòu)，支架與周圍骨斷端分界明顯，觸之較軟。實驗側(cè)與對照側(cè)差別不明顯。術(shù)后8周，雙側(cè)仍可見部分支架輪廓，骨斷端與支架結(jié)合緊密，分界不清，支架下方有少量吸收，實驗側(cè)支架吸收量少于對照側(cè)。術(shù)后12周，實驗側(cè)骨缺損大部分被新生骨組織修復(fù)，新生骨與正常下頜骨組織之間呈骨性愈合，骨斷端處未見外骨痂；對照側(cè)下頜骨下緣處骨缺損大于實驗側(cè)。術(shù)后16周，實驗側(cè)骨缺損大部分被新生骨替代，舌側(cè)形成與正常骨相似的密質(zhì)骨，與正常骨斷端骨性愈合，硬度與周圍骨組織相似（圖6上）；對照側(cè)成骨量小于實驗側(cè)，下頜骨下緣處仍可見骨缺損（圖6下）。

圖4 細胞在PLGA支架上附著生長良好 SEM×1 000Fig 4 Good cell adhesion and growth in the PLGA scaffold SEM×1 000

圖5 支架表面的BMSCs細胞片層結(jié)構(gòu) SEM×1 000Fig 5 Cell sheet microstructure on the surface of scaffold SEM×1 000

2.5 影像學觀察結(jié)果

術(shù)后標本X線片光密度值見表1。由表1可見，實驗側(cè)與對照側(cè)標本X線片光密度值隨術(shù)后時間延長逐漸增加，不同時間點之間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。術(shù)后同一時間點實驗側(cè)光密度值大于對照側(cè)，兩者差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。術(shù)后16周，實驗組光密度值最高，但仍低于周圍正常骨組織（0.677±0.095）。植入材料8～16周可見不規(guī)則的骨小梁影，隨時間增長，骨小梁增多、密集。骨斷端處可見高密度骨折線（圖7）。

圖6 術(shù)后16周，實驗側(cè)（上）和對照側(cè)（下）的大體觀察結(jié)果Fig 6 The general observation of experimental side（up）and control side（down）at 16 weeks post-operation

表1 術(shù)后標本X線片光密度值Tab 1 The optical density of X-ray imaging after operationn＝4，±s

表1 術(shù)后標本X線片光密度值Tab 1 The optical density of X-ray imaging after operationn＝4，±s

分組0.31 4周8周12周16周實驗側(cè) 9±0.001 0.362±0.020 0.378±0.009 0.616±0.044對照側(cè) 0.231±0.005 0.256±0.020 0.326±0.019 0.572±0.042

圖7 術(shù)后16周，實驗側(cè)（上）和對照側(cè)（下）的X線片觀察結(jié)果Fig 7 The X-ray imaging of experimental side（up）and control side（down）at 16 weeks post-operation

2.6 組織學觀察

植入后4、8、12、16周，兩側(cè)的組織學觀察結(jié)果見圖8。術(shù)后4周，實驗側(cè)可見少量新生骨組織，骨小梁纖細，可見纖維性骨痂、多核巨細胞；骨斷端處纖維母細胞及新生血管較多。對照側(cè)新生骨較實驗側(cè)少，骨小梁纖細，不規(guī)則，可見肉芽組織。

圖8 植入后4、8、12、16周，實驗側(cè)和對照側(cè)的組織學觀察結(jié)果 HEFig 8 Histology observation of experimental side and control side at 4,8,12,16 weeks post-operation HE

術(shù)后8周，實驗側(cè)新生骨組織增多，骨小梁增粗，成骨活躍；髓腔周圍見多個骨母細胞；骨斷端處骨小梁排列紊亂，可見類骨質(zhì)。對照側(cè)成骨較實驗側(cè)少，骨小梁較細。術(shù)后12周，實驗側(cè)骨小梁較粗，增多，排列不規(guī)則，可見紅骨髓，髓腔內(nèi)血管豐富，周圍骨母細胞多。對照側(cè)骨小梁增多，較細，骨母細胞較實驗側(cè)少，血管較豐富。術(shù)后16周，實驗側(cè)骨小梁粗大，哈弗氏小管較豐富，周圍有同心圓排列的板層樣骨，骨細胞多且狀態(tài)良好，可見紅骨髓。骨髓腔中血管豐富，有較多鈣鹽沉積。對照側(cè)骨小梁較粗，可見哈弗氏系統(tǒng)，但較實驗側(cè)少。

3 討論

BMSCs可以被誘導(dǎo)分化成多種細胞，如成骨細胞、脂肪細胞等。由于具有這一特性，間充質(zhì)干細胞已經(jīng)被應(yīng)用在很多領(lǐng)域與實驗中。BMSCs只有經(jīng)過特定的誘導(dǎo)分化，接受細胞因子的調(diào)控，合成適當?shù)募毎饣|(zhì)，才能修復(fù)病損或缺失的組織和器官，并使其具有一定的生物功能和組織結(jié)構(gòu)。用BMSCs構(gòu)建組織工程骨有必不可少的三要素：向成骨方向誘導(dǎo)分化的間充質(zhì)干細胞、具有引導(dǎo)成骨作用的支架材料、具有誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)骨形成作用的細胞因子[5]。

本實驗將犬BMSCs經(jīng)成骨方向誘導(dǎo)后植入多孔的可降解的支架材料中，并在支架表面包被BMSCs細胞片層。細胞片層技術(shù)是收獲種子細胞的一種方法，可以對組織工程細胞零傷害，非蛋白酶消化，溫度誘導(dǎo)性收獲。溫度反應(yīng)性培養(yǎng)皿底部為聚異丙基丙烯酰胺水凝膠用電輻射方法結(jié)合到聚苯乙烯培養(yǎng)皿中制作而成的。聚異丙基丙烯酰胺水凝膠為溫度反應(yīng)性材料，用此培養(yǎng)皿培養(yǎng)細胞7～10 d，待細胞鋪滿培養(yǎng)皿底部后，將溫度從37 ℃降到20 ℃，細胞與培養(yǎng)皿底部化合物之間形成一層水化膜，細胞與細胞之間連接得到保留，細胞完整地與培養(yǎng)皿分離形成細胞片層[6]。避免了使用胰酶分離貼壁細胞對細胞的傷害。貼壁的細胞連同細胞下層ECM一同釋放出來。被完整保留的細胞下層ECM確保收獲的連續(xù)細胞具有完整的細胞極性，細胞-細胞連接、細胞層-細胞層間立體連接以及細胞層與移植點之間的連接。獲取細胞片層并非利用溫度反應(yīng)性培養(yǎng)皿一種方法，Nakamura等[7]曾使用細胞刮刀利用普通細胞培養(yǎng)皿成功獲取了細胞片層，但這種細胞片層分離方式為利用細胞刮刀機械性的刮取，需要的技術(shù)性很高，較容易造成細胞損傷。由于細胞片層的諸多優(yōu)勢，現(xiàn)在已經(jīng)被應(yīng)用于多種研究中，Sekine等[8]成功用細胞片層技術(shù)構(gòu)建出具有一定功能的管狀心肌結(jié)構(gòu)。Nishida等[9]利用自體口腔黏膜上皮細胞片層重建角膜組織。Zhou等[10]應(yīng)用細胞片層技術(shù)構(gòu)建出類似于正常骨結(jié)構(gòu)的新生骨組織。本實驗BMSCs片層中細胞排列致密，類似自然骨質(zhì)形成過程中成骨細胞的排列形態(tài)。將成骨細胞組成的細胞片層包裹到多孔支架表面，隨著成骨細胞不斷的合成分泌骨基質(zhì)，以及鈣鹽的沉積和礦化，形成了由多層同心性板層骨圍繞中心哈弗氏小管和哈弗氏系統(tǒng)。

多孔支架材料需要提供給BMSCs一個暫時性的黏附并分泌基質(zhì)的環(huán)境，所以它應(yīng)具有一定的支持結(jié)構(gòu)，能供細胞順利長入的空隙。它還應(yīng)具備一定的生物相容性和生物可降解性，一定的機械強度和可塑性[11]。本實驗所采用的PLGA支架材料具有良好的生物相容性，可應(yīng)用于臨床植入。PLGA呈多孔的三維立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，空隙大小最有利于細胞和血管的生長，孔隙率為85%，利于成骨細胞的生長。相對分子質(zhì)量為100 000，能夠保證支架的降解速率和新生骨的生成速率基本一致。本實驗將支架修整成上寬下窄的形狀，并在背側(cè)修出一個凹槽來容納下頜神經(jīng)血管束，使下牙槽動脈穿過支架內(nèi)部，既保證了支架復(fù)合體的穩(wěn)定，又為大塊組織工程骨血供系統(tǒng)的構(gòu)建創(chuàng)造了條件。

rhBMP-2是一種具有較強誘導(dǎo)成骨作用的生長因子，它可以單獨誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞向成骨細胞方向分化，是骨形成過程中最關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子。VEGF是最有效的促血管生長因子，它能夠刺激血管內(nèi)皮細胞的增殖和生長，促進血管的發(fā)生和血管的通透性。rhBMP-2不僅具有骨誘導(dǎo)活性，還能上調(diào)細胞中VEGF的表達。本實驗在4～16周的標本中血管都比較豐富。應(yīng)用rhBMP-2和VEGF能夠有利于形成具有豐富血管支持的大塊組織工程骨。

本實驗應(yīng)用犬BMSCs細胞片層包裹含有rhBMP-2、VEGF生長因子的PLGA支架，成功構(gòu)建組織工程骨，修復(fù)下頜骨缺損。新生的組織工程骨既有骨小梁和紅骨髓組成的松質(zhì)骨成分，也有哈弗氏系統(tǒng)板層骨等密質(zhì)骨成分，血管豐富，具有良好的硬度，為大塊頜骨缺損的修復(fù)提供了新思路。但組織工程骨的構(gòu)建仍存在諸多問題，如細胞片層技術(shù)在獲取種子細胞時較困難，細胞片層覆蓋支架表面不能深入內(nèi)部發(fā)揮作用等尚待深入研究與解決。

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