茭白胡麻葉斑病病原鑒定及其生物學特性

楊紹麗，吳仁鋒，劉義滿，柯衛(wèi)東，鐘蘭，李建洪

（1.武漢市蔬菜科學研究所，430065；2.華中農(nóng)業(yè)大學植物科學技術(shù)學院）

茭白胡麻葉斑病病原鑒定及其生物學特性

楊紹麗1，吳仁鋒1，劉義滿1，柯衛(wèi)東1，鐘蘭1，李建洪2

（1.武漢市蔬菜科學研究所，430065；2.華中農(nóng)業(yè)大學植物科學技術(shù)學院）

從國家種質(zhì)武漢水生蔬菜資源圃茭白田分離出引起胡麻葉斑病的病原真菌，對該菌進行了形態(tài)學觀察、致病性測定，及其生物學特性研究。結(jié)果表明，引起該病的病原菌為Bipolaris zizaniae。其生物學特性研究表明，病菌菌絲最適宜在PDA和PSA培養(yǎng)基上生長，最適宜在燕麥培養(yǎng)基上產(chǎn)孢；菌絲生長的最適溫度范圍為25～30℃；最適pH值6～8；光照有利于菌絲生長；病菌能夠利用多種碳源和氮源，碳源以可溶性淀粉和乳糖利用效果最好，氮源以硝酸鉀和硝酸鈉利用效果最好；菌絲及分生孢子致死溫度為5℃10 min。

茭白；胡麻葉斑?。徊≡b定；生物學特性

2009-2011年，茭白胡麻葉斑病[1]在國家種質(zhì)武漢水生蔬菜資源圃發(fā)生普遍，并且在主產(chǎn)區(qū)為害嚴重，影響茭白的產(chǎn)量和品質(zhì)，給茭白標準化栽培及茭農(nóng)生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟損失[2，3]。為弄清湖北地區(qū)茭白胡麻葉斑病病原以及該菌對不同理化環(huán)境和營養(yǎng)條件的需求，筆者對其病原進行了鑒定，并對生物學特性進行了較為系統(tǒng)的研究，以期為研究該病害的發(fā)生規(guī)律和防治技術(shù)提供重要理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離與培養(yǎng)

病樣采自國家種質(zhì)武漢水生蔬菜資源圃。采用常規(guī)組織分離法分離病原菌[4]，獲得純化菌株P(guān)DA斜面4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 致病性測定

采用離體葉片接種法測定病原菌致病性。取健康茭白葉片，經(jīng)75%酒精表面消毒后用無菌水沖洗干凈，吸水紙吸去表面的殘留水分，然后平鋪于鋪三層吸水紙（完全浸潤）的瓷盤。在PDA平板上培養(yǎng)5 d的菌落邊緣打取直徑為6 mm的菌餅，挑取單個菌餅放于葉片中間，菌絲面朝下。以空白瓊脂塊接種的葉片作對照。保鮮膜密封瓷盤，置于25℃恒溫光照箱中培養(yǎng)。接種48 h后移去菌餅，待接種葉片表現(xiàn)癥狀后對病斑進行組織分離，在顯微鏡下觀察分離到的病菌是否與接種的病菌相同。

1.3 病原菌的鑒定

將分離純化后得到的單孢菌株于PDA平板中央25℃黑暗培養(yǎng)5 d后觀察菌落形態(tài)，并挑取菌絲制成玻片在顯微鏡下觀察分生孢子和分生孢子梗形態(tài)，測量分生孢子大小。觀察菌株產(chǎn)孢表型，方法參照張?zhí)煊畹萚5]的濾紙片法。

1.4 病原菌生物學特性觀察

①培養(yǎng)基對菌絲生長及產(chǎn)孢的影響 供試5種培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基[4]、PSA培養(yǎng)基[4]、查氏培養(yǎng)基[4]、燕麥培養(yǎng)基[4]、蛋白胨培養(yǎng)基[6]。將PDA平板上培養(yǎng)5 d的菌株沿菌落邊緣用打孔器打直徑6 mm菌餅，分別移置不同培養(yǎng)基平板中央，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每處理3次重復，3 d后按十字交叉法測量菌落的直徑，再培養(yǎng)7 d后測定產(chǎn)孢情況。

②光照對菌絲生長的影響 將PDA平板上培養(yǎng)5 d的菌株沿菌落邊緣用打孔器打直徑6 mm菌餅，接種于PDA平板中央。置于25℃HP250GS智能人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。設連續(xù)黑暗、12 h光暗交替、連續(xù)光照3個處理（光源為普通日光燈18 W，22 cm），每處理3次重復，3 d后按十字交叉法測量菌落直徑。

③溫度對菌絲生長的影響 將PDA平板上培養(yǎng)5 d的菌株沿菌落邊緣用打孔器打直徑6 mm菌餅，接種于PDA平板中央。置5，10，15，20，25，30，35，40℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每處理3次重復，3 d后按十字交叉法測量菌落直徑。

④pH值對菌絲生長的影響 用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl調(diào)節(jié) PDA培養(yǎng)基的 pH值分別為3，4，5，6，7，8，9，10，11，12。在不同pH值的平板上接種直徑為6 mm菌餅，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每個處理3次重復，5 d后按十字交叉法測量菌落直徑。

⑤碳、氮源對菌絲生長的影響 以Czapek培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基[4]。用含碳量相同的葡萄糖、麥芽糖、乳糖、木糖、果糖、可溶性淀粉代替其中的30.0 g蔗糖，以不加碳作對照。用含氮量相同的尿素、硝酸鈉、硝酸銨、氯化銨、精氨酸代替其中的2.00 g硝酸鉀，以不加氮作對照。打取直徑為6 mm的菌餅，接種在不同碳、氮源平板中央，每個處理3次重復。置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5 d后按十字交叉法測量菌落直徑。

⑥菌絲及孢子致死溫度測定 菌絲致死溫度測定：將PDA平板上培養(yǎng)5 d的菌株沿菌落邊緣用打孔器打直徑6 mm菌餅，取菌餅置于無菌試管中，加入2 mL無菌水。分別在35，40，45，50，55，60，70℃水浴鍋中處理10 min后取出試管迅速冷卻，將菌餅取出置于PDA平板上25℃恒溫培養(yǎng)，5 d后觀察其生長情況，每個處理5次重復。

分生孢子的致死溫度測定：在PDA平板上培養(yǎng)10 d以上，向培養(yǎng)皿中加入10 mL滅菌水制備孢子懸浮液，調(diào)節(jié)濃度至1.6×10個/mL孢子，移取1 mL孢子懸浮液于1.5 mL Eeppendorf管中，分別置于45，50，55，60，65，70℃水浴鍋中處理 10 min后取出迅速冷卻。24 h后在顯微鏡下觀察分生孢子萌發(fā)情況，統(tǒng)計孢子萌發(fā)率（%），每處理5次重復。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的鑒定

①病原菌形態(tài)觀察 經(jīng)PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)后，菌落初為灰白色，后期變?yōu)槟G色，氣生菌絲致密，絨狀，有隔（圖1A、1 B、1 C）。25℃黑暗條件下培養(yǎng)10 d后，產(chǎn)生分生孢子。分生孢子以點聚生方式著生于分生孢子梗上（圖1D），分生孢子為黃褐色至褐綠色，倒棍棒形，有假隔膜5~8個，表面光滑，臍略突出，大小為（53.7~96.2）μm×（11.0~22.1）μm（圖1E）。

②產(chǎn)孢表型觀察 保濕培養(yǎng)24 h后在濾紙上可以觀察到濾紙孔邊緣的薄層菌向中央生長。顯微鏡下分生孢子以點聚生的方式著生于分生孢子梗上，每個分生孢子梗上著生不同數(shù)目的分生孢子，并且可以看到不同成熟度分生孢子上隔膜的變化（圖2）。

通過對病原菌菌落形態(tài)、分生孢子形態(tài)大小、分生孢子梗形態(tài)以及產(chǎn)孢表型觀察，結(jié)合真菌分類檢索表及鄧暉[7]的分類研究確定該病菌為Bipolaris zizaniae.。

2.2 致病性測定

將室內(nèi)接種后的茭白葉片置于25℃下生長，48 h后去掉接種的菌餅，這時在葉片上已顯現(xiàn)黃褐色病斑，接種后5 d黃褐色病斑更為明顯。接種10 d后，病部產(chǎn)生分生孢子。從發(fā)病植株上可重新分離得到該病原菌，重新分離到的病原菌的培養(yǎng)性狀、分生孢子形態(tài)、大小，均與當初接種的相同。根據(jù)柯赫氏法則證實Bipolaris zizaniae為致病菌。

2.3 病原菌生物學特性觀察

①培養(yǎng)基對菌絲生長的影響 表1及圖3表明，在5種培養(yǎng)基上，病原菌均能生長，PDA和PSA上菌絲生長最快，查氏培養(yǎng)基不適合菌絲生長。其中能產(chǎn)孢的培養(yǎng)基有 PDA、PSA、燕麥、查氏，且產(chǎn)孢量依次為燕麥＞PDA≥PSA＞查氏。

②光照對菌絲生長的影響 菌株在PDA平板上連續(xù)黑暗、連續(xù)光照、12 h光暗交替條件下培養(yǎng)3 d，菌落平均直徑分別為48.08，64.50，60.08 mm。光照條件較有利于菌絲的生長。

圖1 PDA上的菌落形態(tài)以及分生孢子與分生孢子梗形態(tài)

③溫度對菌絲生長的影響 在 PDA平板上，菌絲在10~35℃下均能生長，適宜溫度為25~30℃，最適為30℃，菌絲在5℃和40℃下不能生長（圖5）。

④pH值對菌絲生長的影響 由圖6可以看出，PDA培養(yǎng)基pH值3～12時，菌株均可生長，以pH值6～8最適，當 pH值為7時，菌絲生長量最大，說明接近中性環(huán)境更適宜病原菌生長。

⑤碳、氮源對菌絲生長的影響 從表2可以看出，蔗糖、乳糖等7種碳源均能被利用，其中菌絲在可溶性淀粉中生長最好，其次為乳糖，果糖最差；硝酸鉀、尿素等6種氮源均能被利用，其中菌絲生長以硝酸鉀利用最好，其次為硝酸鈉、硝酸銨，氯化銨最差。在無碳和無氮培養(yǎng)基上該菌也能夠生長，但菌落較稀疏。

⑥菌絲及孢子致死溫度測定 試驗結(jié)果表明，水溫50℃下處理10 min后，菌絲在PDA培養(yǎng)基上均能再生長，而在55℃水浴處理10 min后，每個重復均無菌絲生長；分生孢子在55℃水浴處理10 min后均不能再萌發(fā)，說明55℃的溫水處理10 min可殺死菌絲體，抑制孢子萌發(fā)。

圖2 濾紙片上培養(yǎng)24 h菌株產(chǎn)孢表型觀察

表1 茭白胡麻葉斑病菌菌株在各培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀

圖3 不同培養(yǎng)基對菌絲生長的影響

圖5 不同溫度對菌株菌絲生長的影響（3 d）

圖4 不同光照對菌絲生長的影響

圖6 不同pH值對菌株菌絲生長的影響（5 d）

3 小結(jié)與討論

據(jù)筆者調(diào)查，武漢茭白胡麻葉斑病在每年5月中下旬，溫度在20℃開始有零星發(fā)生，隨著氣溫升高病害迅速蔓延，6~7月發(fā)生為害最重，這與本試驗中菌絲生長適宜溫度范圍為25~ 30℃，30℃菌絲生長最快的結(jié)果基本一致。王建等[8]報道茭白胡麻葉斑病菌菌絲生長和產(chǎn)孢的最適溫度都為25℃，而每年7~8月的平均氣溫為24~ 28℃，濕度大，該病大面積流行和蔓延，這與安徽省岳西縣地處大別山區(qū)的地理環(huán)境相適應。本研究中病原菌能夠利用多種碳、氮源，碳源以可溶性淀粉和乳糖利用效果最好，而此研究結(jié)果與王建等[8]研究結(jié)果較一致。在氮源利用上，硝態(tài)氮比其他幾種氮的利用效果好且差異顯著，表明在各種氮源中病原菌對硝態(tài)氮的利用優(yōu)于氨態(tài)氮，可以利用該菌對碳源利用的差異來合理施肥，控制病害的發(fā)生。

經(jīng)病原菌的分離培養(yǎng)、形態(tài)學鑒定以及柯赫氏法則的驗證，引起湖北茭白胡麻葉斑病的病原為Bipolaris zizaniae，為半知菌亞門長蠕孢屬真菌。對病原菌生物學特性研究了解到茭白胡麻葉斑病菌是一種能夠以多種碳氮源為營養(yǎng)來源、適宜中性環(huán)境、耐高溫的病原真菌。本文研究了部分環(huán)境因子和營養(yǎng)物質(zhì)對菌絲生長和產(chǎn)孢的影響，還需進一步研究其他因子如相對濕度等對病菌生長和發(fā)育的影響，以及研究分生孢子生物學特性，為了解病菌的侵染和病害流行奠定基礎(chǔ)。

表2 不同碳源、氮源對菌株菌絲生長的影響

表3 菌株菌絲生長的致死溫度

[1]呂佩珂，蘇慧蘭，高振江，等．中國現(xiàn)代蔬菜病蟲原色圖鑒[M]．呼和浩特：遠方出版社，2008．

[2]柯衛(wèi)東．茭白胡麻葉斑病的發(fā)生及防治[J]．湖北農(nóng)業(yè)科學，1990（1）：26，33．

[3]葉琪明，顧建國，李建榮，等．茭白銹病和胡麻斑病的發(fā)生規(guī)律及其無害化防治[J].浙江農(nóng)業(yè)學報，2003，15（3）：144-148．

[4]方中達主編．植病研究方法.3版[M]．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998．

[5]張?zhí)煊睿袊婢荆ǖ谑恚╂湼矜邔賉M]．北京：科學出版社，2003.

[6]黃思良，趙艷珠，黃連江，等．不同培養(yǎng)基對芒果炭疽病菌分生孢子形成的影響[J].西南農(nóng)業(yè)學報，1998，11（1）：62-66．

[7]鄧暉．中國平臍蠕孢屬（BipolarisShoemaker）的分類研究．[D]．山東：山東農(nóng)業(yè)大學，2002．

[8]王建，朱世東，袁凌云，等．茭白胡麻斑病菌生物學特性研究[J].中國農(nóng)學通報，2007，23（11）：279-300．

Etiological and Biological Characteristics of Pathogenic Fungus Causing Brown Spot onZizania latifoliaTurcz.

YANG Shaoli1,WU Renfeng1,LIU Yiman1,KE Weidong1,ZHONG Lan1,LI Jianhong2
(1.Wuhan Vegetable Research Institute,430065;2.College of Plant Science and Technology,Huazhong Agricultural University)

We isolated a pathogen causing brown spot fromZizania latifoliaTurcz.fields in the National Aquatic Vegetables Resources Nursery of Wuhan,and we studied its morphological characteristics,pathogenicity and biological characteristics. The results showed that the pathogen wasBipolaris zizaniae,and PDA and PSA were suitable for mycelial growth,while oats medium was beneficial for producing spores.The optimal temperature for the mycelial growth was 25-30℃,with the optimal pH value of 6-8,and light promoted the growth of mycelial.The pathogen could make use of various carbon and nitrogen sources,and soluble starch,lactose,potassium nitrate and sodium nitrate were best for mycelial growth.The lethal temperature for mycelial growth and spores germination were 55℃for 10 min.

Zizania latifoliaTurcz.;Brown spot;Pathogen identification;Bio1ogical characteristics

10.3865/j.issn.1001-3547.2012.16.035

國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（200903017-08）楊紹麗（1981-），女，助理農(nóng)藝師，碩士，研究方向蔬菜病害診斷及防控，E-mail：yangshaoli0123@163.com

吳仁鋒（1973-），通信作者，男，高級農(nóng)藝師，碩士，主要從事蔬菜病害診斷及綜合防控研究，E-mail：wuhanwurenfeng@126.com

2012-07-04