羅格列酮對(duì)小鼠急性肝衰竭保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究

司徒小紅

本研究通過D-GalN聯(lián)合LPS腹腔注射構(gòu)建小鼠急性肝衰竭模型，探討其誘導(dǎo)急性肝衰竭的可能機(jī)制;并以羅格列酮干預(yù)，觀察小鼠24h存活率、肝組織的病理改變、肝臟酶學(xué)水平以及肝組織中TNF-α、TGF-β1的表達(dá)，觀察羅格列酮對(duì)急性肝衰竭是否有保護(hù)作用，并研究其可能的作用機(jī)制。

材料與方法

1.研究對(duì)象 昆明小鼠:6～8周齡，雄性，清潔級(jí)，體重2鮑左右，購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性預(yù)養(yǎng)一周。

2.主要試劑材料:細(xì)菌脂多糖(LPs)，美國(guó)Sigma公司;D-氨基半乳糖，重慶醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程研究室;馬來酸羅格列酮片，葛蘭素一史克制藥公司。

3.主要儀器:全自動(dòng)紫外分光光度計(jì)，美國(guó)Beckman公司;電子天平，上海第二天平廠;低溫高速離心機(jī)，美國(guó)PE公司;-70℃立式超低溫冰箱，上海天能科技有限公司;全自動(dòng)生化分析儀，日本sanyo公司;170℃高溫烤箱，北京六一儀器廠。

4.構(gòu)建小鼠急性肝衰竭模型:雄性昆明小鼠100只，隨機(jī)分為5組，每組分別以 D-GalN 400 mg/kg聯(lián)合LPS 10 U/kg，D-GalN 500 mg/kg聯(lián)合LpS 10 μg/kg，D-GalN 600 mg/kg 聯(lián)合 LPS 10 U/kg，D-GalN 700 mg/kg 聯(lián)合 LPS 10 μg/kg 腹腔注射，正常組以生理鹽水腹腔注射，觀察各組小鼠24h存活率。

5.羅格列酮干預(yù):雄性昆明小鼠60只，隨機(jī)分為A、B、C3組，每組20只，選擇羅格列酮20 mg/kg作為治療劑量。A組為正常組，B組為對(duì)照組，C組為羅格列酮治療組。B組和c組分別予以D-GalN 600 mg/kg聯(lián)合LPS 10 μg/kg腹腔注射構(gòu)建小鼠急性肝衰竭模型，c組于造模前2h以羅格列酮20 mg/kg灌胃，B組相應(yīng)在造模前2h以生理鹽水灌胃;A組均在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)予以生理鹽水灌胃及腹腔注射。造模后6h，每組隨機(jī)選擇5只小鼠去眼球采血，血標(biāo)木于37℃水浴半小時(shí)后以3000 r/min離心10分鐘，取血清保存于-70℃冰箱中，用于待測(cè)血清轉(zhuǎn)氨酶;再隨機(jī)選擇5只小鼠斷頸處死，無菌取約100mg肝組織置于去酶EP管中并保存于速凍液氮內(nèi)，再轉(zhuǎn)存于-70℃冰箱，以待提取總RNA;另取小塊肝組織于10%中性磷酸緩沖福爾馬林液中固定，用于HE染色。

6.血清轉(zhuǎn)氨酶的檢測(cè):采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)。

結(jié) 果

1.不同劑量羅格列酮對(duì)D-GalN/LPS小鼠24h存活率的影響見表1。

表1 不同劑量羅格列酮對(duì)D-GalN/LPS小鼠24h存活率的影響

2.羅格列酮對(duì)D-GaIN/LPS小鼠血清轉(zhuǎn)氮酶的影響由表2可見，正常組小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶ALT水平為(47.4±6.3)U/L、AST 水平為(62.8 ±5.7)U/L，對(duì)照組小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶ALT水平為(3664.8±646.1)U/L、AST 水平為(3514.0 ±468.9)U/L，羅格列酮治療組小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶ALT水平為(403.6±76.1)U/L、AST 水平為(464.6 ±63.0)U/L。對(duì)照組ALT和AST水平均顯著高于正常組，而治療組ALT和AST水平較對(duì)照組顯著降低(P＜0.05)。

表2 羅格列酮對(duì)D-GaIN/LPS小鼠血清轉(zhuǎn)氮酶的影響

討 論

急性肝衰竭來勢(shì)兇猛采取積極、有效的措施阻止病情的迅速進(jìn)展是治療的關(guān)鍵所在，這就需要我們更好地了解疾病發(fā)生的細(xì)胞、分子、蛋白和基因等方面的機(jī)制。開發(fā)、驗(yàn)證新的治療方法，除了通過臨床研究對(duì)人類患者直接觀察外，采用動(dòng)物模型開展實(shí)驗(yàn)研究己成為科研攻關(guān)不可缺少的手段之一。建立一個(gè)成功的急性肝衰竭動(dòng)物模型，對(duì)研究其機(jī)理、驗(yàn)證療效有著非常重要的意義［1］。結(jié)果表明，正常組小鼠肝組織僅有少量TNF-α mRNA的表達(dá)，對(duì)照組肝組織中TNF-α mRNA的表達(dá)較正常組顯著增強(qiáng)，并與肝細(xì)胞炎癥壞死程度呈正相關(guān)，說明TNF-α和肝細(xì)胞壞死有著非常密切的關(guān)系，進(jìn)一步推測(cè)D-GalN/LPS可能通過上調(diào)TNF-α的表達(dá)而導(dǎo)致肝細(xì)胞炎癥壞死乃至急性肝衰竭。大量的實(shí)驗(yàn)已證實(shí)在急性肝衰竭中，除了細(xì)胞炎癥壞死這一死亡形式外，也存在著細(xì)胞凋亡。絕大多數(shù)的細(xì)胞凋亡依賴于caspase的激活，Caspase是一種半胱氨酸蛋白酶，半胱氨酸殘基是其催化活性所必需的，目前己鑒定的哺乳動(dòng)物caspase有14種，在細(xì)胞凋亡的執(zhí)行期發(fā)揮關(guān)鍵作用，并與凋亡的形態(tài)學(xué)特征密切相關(guān)。正常情況下細(xì)胞內(nèi)caspase與其抑制劑總是共存的，以免CasPase酶原被意外激活對(duì)正常細(xì)胞造成損傷。而活化的Caspase能夠特異性的水解蛋白底物，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因其在凋亡過程中的重要作用，有人認(rèn)為caspase是凋亡的執(zhí)行者，亦有人將其譽(yù)為“凋亡步兵”或“凋亡劊子手”。

基于羅格列酮具有抗炎、抗氧化和抗凋亡等作用，而急性肝衰竭與肝細(xì)胞的炎癥、壞死及凋亡有密切關(guān)系，故羅格列酮是否也可用于急性肝衰竭的治療，目前國(guó)內(nèi)外尚未見相關(guān)報(bào)道［2］。本實(shí)驗(yàn)通過羅格列酮干預(yù)小鼠急性肝衰竭模型，觀察其對(duì)急性肝衰竭是否有保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)羅格列酮可明顯降低小鼠急性肝衰竭的24小時(shí)死亡率，與對(duì)照組比較，死亡率下降40個(gè)百分點(diǎn)，差異有顯著性。

總之，肝衰竭的發(fā)病機(jī)制及其復(fù)雜，至今尚未找到一種能阻止肝衰竭進(jìn)展的特效藥物［3］。正因如此，緊密結(jié)合臨床到深入的實(shí)驗(yàn)研究，探索肝衰竭的發(fā)病機(jī)制，并據(jù)其發(fā)病機(jī)制研發(fā)更有效的防治手段是肝衰竭發(fā)病機(jī)制研究及治療發(fā)展的方向，具有重大意義及廣闊的前景。目前國(guó)內(nèi)外未見關(guān)于羅格列酮治療急性肝衰竭以及其作用機(jī)制的研究報(bào)道，故將此研究進(jìn)一步完善和深入，將為急性肝衰竭的臨床研究和藥物開發(fā)提供一個(gè)新的方向［4］。

D-GalN 600 mg/kg聯(lián)合 LPs l0 μg/Kg腹腔注射成功構(gòu)建了小鼠急性肝衰竭模型;其可能通過上調(diào)TNF-α、TGF-β1的表達(dá)導(dǎo)致急性肝衰竭。羅格列酮對(duì)D-GalN/LPS小鼠急性肝衰竭有明顯的保護(hù)作用，可改善肝細(xì)胞炎癥和壞死，降低急性肝衰竭的死亡率，其機(jī)制可能與羅格列酮下調(diào)TNF-α、TGF-βl的表達(dá)有關(guān)。

1 陳立平，周巧玲，歐陽春，等.羅格列酮對(duì)糖尿病腎病大鼠足細(xì)胞nephrin和 podocin表達(dá)的影響?J?.中華腎臟病雜志，2007，23(4):263-264.

2 Panchapakesan U，Pollock CA，Chen XM.The effeet of PPAR-gamma agonists on PPAR-gamma expression and function in HK-2 cells?J?.Am J Physiol，2004，287(3):528-534.

3 劉章鎖，牛紅心，程根陽，等.羅格列酮對(duì)糖尿病大鼠腎保護(hù)機(jī)制的研究評(píng)論?J?.中華腎臟病雜志，2004，20(2):109-112.

4 林茂松，陳衛(wèi)昌，白霞.羅格列酮對(duì)大腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)影響的研究?J?.蘇州大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，25(2):197-200.