單壁碳納米管在LB培養(yǎng)基及生理鹽水中的抗菌性研究

趙金明 趙 云 黃 慶 呂 敏,3 李 江 楊夏峰

1 (四川大學生命科學學院 成都 610065)

2 (中國科學院上海應用物理研究所物理生物實驗室 上海 201800)

3 (中國科學院院研究生院 北京 100049)

碳納米管(CNTs)由于其具有極高的強度、韌性和電子傳遞性能，獨特的生物應用性，已引起廣泛關(guān)注[1–9]。有關(guān)CNTs的制備方法、其結(jié)構(gòu)和性能相關(guān)[5–14]的研究報道非常多，而研究 CNTs對微生物生長影響的報道則較少[2–4]。Menachem等[2]對單壁碳管(SWNTs)抑制大腸桿菌(E.coli)生長作了研究，結(jié)果表明，在生理鹽水條件下，SWNTs濃度僅為0.5 μg/mL時，其抑菌效率高達90%以上，而其抑菌機理為機械性損傷細胞膜，使細胞破裂損壞，胞質(zhì)外流，從而導致細菌死亡。Simmons等[3]用純SWNTs和聚乙烯吡咯烷酮碘制成復合性抗菌材料，發(fā)現(xiàn)此材料具有良好的抗菌性能，抑菌率亦高達90%以上，其抗菌機理為碘與SWNTs協(xié)同作用。但是，上述研究的實驗環(huán)境均為生理鹽水或磷酸緩沖液等非細菌培養(yǎng)基體系，僅諸穎等[4]驗證了多壁碳管(MWNTs)在含有蛋白的培養(yǎng)基中被四膜蟲吸收后并無毒性產(chǎn)生。而在培養(yǎng)基中SWNTs對細菌生長的影響則未見報道。

本文以 SWNTs為材料，以革蘭氏陽性菌(G+)枯草芽孢桿菌(B.subtilis)為研究對象，分別在在生理鹽水及LB培養(yǎng)基兩種環(huán)境下，研究了SWNTs的抗菌性能對培養(yǎng)條件的依賴性。并通過測定生理鹽水體系中 SWNTs對枯草芽孢桿菌(B.subtilis)刺激是否產(chǎn)生氧自由基(ROS)，探討SWNTs的抗菌機理。

1 實驗材料和方法

1.1 試劑與儀器

SWNTs(美國阿爾法公司)，LB培養(yǎng)基(固體，液體)，0.9%生理鹽水，去離子水。

掃描電鏡(Hitachi S-2400，日立公司)、透射電鏡(joel JEM-1230，日本電子公司)、紫外光譜儀(日立 U-3010)、多功能酶標儀(TECAN infinite，tecan公司，奧地利)。

1.2 抗菌性能測試

取濃度～109/mL枯草芽孢桿菌(B.subtilis)菌液1 mL，10000 r/min離心1 min，生理鹽水重懸，按連續(xù)稀釋法用生理鹽水將菌液稀釋100倍，得到～107/ mL菌液，備用。

實驗組為2.87 mL生理鹽水或LB培養(yǎng)基中加入30 μL濃度為0.5 mg/mL的SWNTs溶液?；靹蚝螅尤?00 μL濃度為～107/mL菌液；對照組為2.9 mL生理鹽水中加入同樣濃度的100 μL菌液。

上述體系置于試管中，棉塞封口，試管置于搖床內(nèi)，在37oC、200 r/min條件下避光培養(yǎng)1 h。每管取100 μL (對照組用連續(xù)稀釋法稀釋100倍后取100 μL)涂板(每個樣品涂三塊平板)。平板置于37oC恒溫箱中培養(yǎng)18 h，實驗重復3次。觀測并統(tǒng)計菌落數(shù)目。對照組菌落數(shù)目標記為C0，樣品菌落數(shù)目標記為CS，抑菌率R=[(C0–CS)/C0]×100%。

1.3 生長曲線測定

構(gòu)建培養(yǎng)體系：實驗組為28.7 mL LB培養(yǎng)基加入300 μL濃度為0.5 mg/mL的SWNTs溶液，混勻后加入1000 μL濃度為～107/mL菌液；對照組為29 mL生理鹽水中加入同樣濃度的1000 μL菌液。

上述體系分別盛入150 mL錐形瓶(高溫高壓濕熱滅菌并烘干)，置于37oC、200 r/min搖床中培養(yǎng)，從0 h開始，每隔一個小時取1 mL菌液，到第17 h終止，用紫外光譜儀測定OD600并記錄。

1.4 ROS測定

所用探針為H2DCFA，初始濃度為20 mmol/L，稀釋1000倍后備用，按以下分組并在室溫、避光條件下孵育30 min：對照組、H2O2和SWNTs三組樣品中各加入H2DCFA探針800 μL，濃度為～109/mL的菌液200 μL；空白組不加H2DCFA，加入濃度為～109/mL的菌液200 μL。

按104r/min離心1 min，用生理鹽水重懸，再離心，棄上清，之后用生理鹽水重懸從而洗去多余探針。對照組加入200 μL生理鹽水，H2O2組加入200 μL濃度為400 μmol/L的雙氧水，SWNTs組加入200 μL濃度為5 μg/mL的SWNTs生理鹽水溶液，以上與菌液充分混勻后加入到96孔板中，置于酶標儀中，設置激發(fā)光波長488 nm，吸收光波長525 nm，測定30 min時的吸收值。

特別注明，由于SWNTs本身能夠氧化DCFHDA，產(chǎn)生熒光，故特設一個相同濃度的純SWNTs樣品，處理數(shù)據(jù)時，有SWNTs存在的樣品組減去同時間所測得純SWNTs樣品的熒光值。

2 結(jié)果與討論

2.1 SEM和TEM電鏡分析

純SWNTs的TEM及SEM圖像分別見圖1(a)和圖1(b)，LB培養(yǎng)基中SWNTs的SEM圖像見圖1(c)，培養(yǎng)有枯草芽孢桿菌的LB培養(yǎng)基中SWNTs的SEM圖像見圖1(d)。由圖1(b)和圖1(c)，在LB培養(yǎng)基存在條件下，碳管有明顯聚集并伴隨有蛋白吸附；由圖1(d)，碳管聚集的同時也富集了LB培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)，使周圍細菌能附著在聚集物上生長。

圖1 SWNTs透射電鏡(TEM)圖及掃描電鏡(SEM)圖(a) SWNTs的TEM圖, (b) SWNTs的SEM圖, (c) 培養(yǎng)基中加入單臂碳管后培養(yǎng)大腸桿菌的SEM圖, (d) 培養(yǎng)有枯草芽孢桿菌的LB培養(yǎng)基中SWNTs的SEM圖Fig.1 TEM and SEM image of SWNTs.(a) TEM image of SWNTs, (b) SEM image of SWNTs, (c) SEM image of E.coli cultured with SWNTs in LB, (d) SEM image of B.subtilis cultured with SWNTs in LB

2.2 抑菌效果及抑菌機理探討

實驗采用統(tǒng)計枯草芽孢桿菌菌落的方法測定SWNTs抑菌率，如圖2所示，在生理鹽水體系中，SWNTs的抑菌率達99.92%，但在培養(yǎng)基存在的條件下，SWNTs基本喪失抑菌性能。對照圖1，可以看出在LB培養(yǎng)基中SWNTs明顯有團聚現(xiàn)象，管壁上有蛋白附著，營養(yǎng)化富集，導致SWNTs抑菌性能喪失，細菌最終濃度高于普通水平。

圖2 SWNTs在生理鹽水和LB體系中的抑菌率Fig.2 Inactivation efficiency of SWNTs in LB culture and in a saline solution.

文獻[2]認為，SWNTs對大腸桿菌的殺滅機理是機械損傷細胞膜。在 SWNTs對枯草芽孢桿菌(B.subtilis)殺滅過程中，我們研究了其是否還存協(xié)同作用，即細胞膜機械破損的同時還有氧化損傷。即測定生理鹽水體系中枯草芽孢桿菌產(chǎn)生氧自由基(ROS)的量(圖3)?？莶菅挎邨U菌受SWNTs影響產(chǎn)生ROS的量遠小于正常水平，結(jié)合SWNTs殺滅細菌的時間很短(<1h)，說明在生理鹽水體系中，SWNTs對枯草芽孢桿菌(B.subtilis)的殺滅作用是一個急性機械破膜殺滅過程。

圖3 生理鹽水體系中枯草芽孢桿菌受SWNTs影響產(chǎn)生ROS的量Fig.3 ROS caused by SWNTs in a saline solution.

2.3 生長曲線測定結(jié)果及討論

圖4為LB體系中，正常培養(yǎng)基以及有SWNTs存在的培養(yǎng)基中枯草芽孢桿菌(B.subtilis)的生長曲線。顯示在SWNTs的LB培養(yǎng)基中，枯草芽孢桿菌(B.subtilis)終濃度高于對照組，其中15 h時平均濃度為5.7×109/mL，而對照組15 h時細菌平均濃度為5.3×109/mL，說明在LB培養(yǎng)基中，SWNTs會促進細菌生長，作為一種細菌生長促進因子，使細菌終濃度高于正常水平。

圖4 LB體系中枯草芽孢桿菌(B.subtilis)生長曲線Fig.4 Growth curve of B.subtilis in LB culture.

3 結(jié)語

(1) 生理鹽水條件下，SWNTs具有極佳的抗菌、殺菌性能。

(2) 生理鹽水條件下，SWNTs對細菌的殺滅作用是急性機械損傷細胞膜，同時，無氧化損傷作用或氧化損傷作用極小。

(3) 在LB培養(yǎng)基中，SWNTs可作為細菌生長的促進因子，促進細菌生長，使細菌菌液終濃度高于正常水平。

(4) SWNTs的抑菌性具有條件依賴性，在生理鹽水及在細菌培養(yǎng)基中，其抑菌性能表現(xiàn)迥異。

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