黃山野菊花揮發(fā)油體外抗氧化活性

趙秀玲，文飛龍，李長龍

(黃山學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，安徽 黃山，245021)

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黃山野菊花揮發(fā)油體外抗氧化活性

趙秀玲，文飛龍，李長龍

(黃山學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，安徽 黃山，245021)

以ABTS自由基、DPPH自由基和NaNO2的清除作用為指標(biāo)，評價黃山野菊花揮發(fā)油體外抗氧化活性。結(jié)果表明：黃山野菊花揮發(fā)油對ABTS自由基、DPPH自由基和亞硝酸鈉有清除作用的IC50值分別為74.75，97.44，45.60 μL。黃山野菊花揮發(fā)油對ABTS自由基、DPPH自由基和亞硝酸鈉的清除能力均高于0.1 g/L Vc。黃山野菊花揮發(fā)油具有較好的體外抗氧化活性。

黃山野菊花；揮發(fā)油；體外抗氧化活性

自由基在信號傳導(dǎo)和免疫等方面具有重要的作用，但過多的活性氧自由基就會產(chǎn)生破壞行為，通過鏈?zhǔn)椒磻?yīng)攻擊細(xì)胞內(nèi)或體液中的生物分子，如：DNA，脂質(zhì)，蛋白質(zhì)等[1，2]。自由基極不穩(wěn)定，時刻伺機(jī)尋找可以結(jié)合的分子，一旦和其它分子結(jié)合會損害正常細(xì)胞，甚至于產(chǎn)生新的細(xì)胞——腫瘤細(xì)胞。亞硝酸鹽廣泛存在于自然界環(huán)境和食物中，在體內(nèi)亞硝酸鹽會轉(zhuǎn)化為亞硝胺，亞硝胺是目前世界上公認(rèn)的三大強(qiáng)致癌物之一，能通過胎盤和乳汁引發(fā)后代腫瘤，它可以在人體中合成，是一種很難完全避開的致癌物質(zhì)[3]。

黃山野菊花產(chǎn)于皖南黃山山脈，為菊科植物ChrysanthemumindicumL.的干燥頭狀花序，中國藥典2010年版已把其收入其中，具有清熱解毒、疏風(fēng)平肝之功效，用于治療瘡、癰腫、丹毒、風(fēng)熱感冒、咽喉腫痛、高血壓、眩暈、頭痛等?，F(xiàn)狀藥理研究表明：野菊花具有廣譜抗菌、抗病毒、降壓、增加冠脈血流量、清除氧自由基等作用[4]。野菊花中富含黃酮類，有機(jī)酸類、萜類、揮發(fā)油等化學(xué)成分[5]。本次研究以Vc和BHT作為陽性對照，研究黃山野菊花揮發(fā)油對DPPH自由基、ABTS自由基和NaNO2的清除能力，并研究其抗氧化作用，以期為黃山野菊花的保健功能和開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃山野菊花購自黃山市茶葉市場,經(jīng)黃山學(xué)院生命與環(huán)境學(xué)院潘健博士鑒定為菊科植物ChrysanthemumindicumL.的干燥頭狀花序。1，1-二苯基苦基苯肼(DPPH)(梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司生產(chǎn))；2，2-聯(lián)氮基-雙-C3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨鹽(ABTS)Regal Biotechnology Company；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

揮發(fā)油提取器；UV754N紫外可見分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn))。

1.2 方法

1.2.1 黃山野菊花揮發(fā)油的提取 準(zhǔn)確稱取粉碎后的黃山野菊花樣品20 g，置于燒瓶中，用揮發(fā)油提取器按水蒸汽蒸餾法提取6 h，得到具有濃郁香味的淡黃色透明油狀物。無水硫酸鈉干燥后用丙酮稀釋成體積分?jǐn)?shù)為0.20的黃山野菊花揮發(fā)油，備用。

1.2.2 黃山野菊花揮發(fā)油對DPPH自由基清除作用的測定[6，7]取20，40，60，80，100 μL的體積分?jǐn)?shù)為0.20的黃山野菊花揮發(fā)油，然后依次加入丙酮80，60，40，20，0 μL，加入24 mg/L的DPPH乙醇溶液(體積分?jǐn)?shù)0.95)4 mL，避光2 h，在波長517 nm處測吸光度(Ai)，以不加樣品的DPPH乙醇為對照，測定對照組的吸光度(A0)。IC50 值定義為清除50%自由基所需的樣品質(zhì)量濃度(或體積數(shù))，其計算是通過獲得的DPPH自由基回歸方程所得。以0.1 g/L Vc為對照，按照上述相同的方法測定其對DPPH自由基的清除率。以黃山野菊花揮發(fā)油和Vc的用量(μL)為橫坐標(biāo)(x), DPPH自由基清除率為縱坐標(biāo)(y)作圖，分析黃山野菊花揮發(fā)油對DPPH自由基的清除能力。清除率=(1-Ai/A0)×100%。

1.2.3 清除NaNO2能力的測定 按文獻(xiàn)[8]的方法測定黃山野菊花揮發(fā)油對NaNO2的清除率。將0.5 g/L的檸檬酸鈉-鹽酸緩沖液(pH 3.0)5.0 mL置于10 mL容量瓶中，加入1.0 mL 100 mg/L的NaNO2溶液和20，40，60，80，100 μL體積分?jǐn)?shù)為0.20黃山野菊花揮發(fā)油，用蒸餾水定容至刻度，37 ℃下反應(yīng)1 h。取1 mL反應(yīng)液加入4 g/L對氨基苯磺酸溶液2 mL和2 g/L N-1-萘乙二胺鹽酸鹽1 mL，搖勻放置15 min，在540 nm處測吸光度值A(chǔ)x；同時做對照實(shí)驗測其吸光度A0。以0.1 g/L Vc為陽性對照，按照上述相同的方法測定其對NaNO2的清除率。清除率=[(A0-Ax)/A0]×100%。

以黃山野菊花揮發(fā)油和Vc的用量(μL)為橫坐標(biāo)(x)，NaNO2清除率為縱坐標(biāo)(y)，作圖分析黃山野菊花揮發(fā)油對NaNO2的清除能力，并由NaNO2的回歸方程計算IC50。

1.2.4 黃山野菊花揮發(fā)油對ABTS自由基清除作用[9]采用文獻(xiàn)[9]的方法，并加以改進(jìn)。將等量7.00 mmol·L-1ABTS溶液與2.45 mmol·L-1過硫酸鉀混合，置于暗處12～16 h。用甲醇將ABTS溶液稀釋，在734 nm吸光度0.70±0.02。取20，40，60，80，100 μL體積分?jǐn)?shù)為0.20的黃山野菊花揮發(fā)油，加入80，60，40，20，0 μL丙酮定容，加入2 mL ABTS溶液，6 min后測量在波長734 nm的吸光度(Ai)；以2 mL丙酮代替ABTS溶液，測定吸光度(Aj);測定2 mL ABTS溶液與100 μL丙酮混合后的吸光度(A0)。清除率=[(A0-Ai+Aj)/A0]×100%。以0.1 g/L Vc為對照，按照上述相同的方法測定其對ABTS自由基的清除率。

以黃山野菊花揮發(fā)油和Vc的用量(μL)為橫坐標(biāo)(x)，自由基清除率為縱坐標(biāo)(y)，作圖分析黃山野菊花揮發(fā)油對ABTS自由基的清除能力，并由ABTS自由基回歸方程計算IC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃山野菊花揮發(fā)油對DPPH自由基的清除率

水蒸汽蒸餾法提取到的野菊花揮發(fā)油為有濃郁香味的淡黃色透明液體，提取率為0.46%。

DPPH自由基是一種被廣泛使用的用來測定生物材料抗氧化活性的穩(wěn)定的色原物質(zhì)[10]，在有機(jī)溶劑中是一種穩(wěn)定的、以氮為中心的質(zhì)子自由基，廣泛用于天然產(chǎn)物抗氧化活性的研究[11]。在清除DPPH自由基實(shí)驗中，抗氧化劑對DPPH自由基的清除能力表現(xiàn)為它們提供氫質(zhì)的能力[12]。本次試驗中，隨著黃山野菊花揮發(fā)油和Vc使用量的增加，對DPPH自由基的清除作用逐漸增強(qiáng)，兩者呈量效關(guān)系，但隨著黃山野菊花揮發(fā)油和Vc使用量的增加，清除率增加幅度逐漸降低(圖1)。體積分?jǐn)?shù)為0.20的黃山野菊花揮發(fā)油對DPPH的清除效果優(yōu)于0.1 g/L Vc。當(dāng)使用量為20 μL時，黃山野菊花揮發(fā)油對DPPH清除率是Vc的1.81倍。體積分?jǐn)?shù)為0.20的黃山野菊花揮發(fā)油的使用量(X)與對DPPH的清除率(Y)之間的回歸方程為Y=18.667+0.322X(R2=0.950 7); 0.1 g/L Vc的使用量(X)與對DPPH的清除率(Y)之間的回歸方程為Y=15.156+0.209X(R2=0.719 6)。

圖1 黃山野菊花揮發(fā)油對DPPH自由基的清除作用

抗氧化劑清除自由基的能力以半數(shù)抑制濃度(IC50)來比較，其定義為：使自由基數(shù)目減少50%時所需要樣品濃度(或體積)。經(jīng)計算，體積分?jǐn)?shù)為0.20的黃山野菊花揮發(fā)油、0.1 g/L Vc的IC50分別為97.444，166.320 μL。與0.1 g/L Vc比較，體積分?jǐn)?shù)為0.20的黃山野菊花揮發(fā)油清除DPPH自由基的效果更好。

2.2 黃山野菊花揮發(fā)油對NaNO2的清除作用

由于過度使用氮肥，食物原料中的硝酸鹽含量經(jīng)常偏高，轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽之后，可能和蛋白質(zhì)產(chǎn)物合成亞硝胺，成為誘發(fā)胃癌等癌癥的隱患。當(dāng)黃山野菊花揮發(fā)油使用量在20～40 μL時，隨著使用量的增加，對NaNO2清除率迅速增加，此時加入的黃山野菊花揮發(fā)油量較少，揮發(fā)油完全溶解在溶液中，完全和NaNO2反應(yīng)，所以清除率增幅很快(圖2)。黃山野菊花揮發(fā)油使用量在40～100 μL時，隨著使用量的增加，對NaNO2的清除作用也在逐漸增加，但是增長速率下降。隨著使用量的增加，清除率呈緩慢增長趨勢。體積分?jǐn)?shù)為0.20的黃山野菊花揮發(fā)油的使用量(X)與對NaNO2的清除率(Y)之間的回歸方程為Y=36.883+0.287 7X(R2=0.709 2); 0.1 g/L Vc的使用量(X)與對NaNO2的清除率(Y)之間的回歸方程為Y=5.062+0.153 3X(R2=0.926)。經(jīng)線性回歸計算，體積分?jǐn)?shù)為0.20的黃山野菊花揮發(fā)油與0.1 g/L Vc的IC50分別為45.601，293.134 μL?？梢婓w積分?jǐn)?shù)為0.20的黃山野菊花揮發(fā)油對NaNO2的清除能力明顯優(yōu)于0.1 g/L Vc。

2.3 黃山野菊花揮發(fā)油對ABTS的清除作用

Miller等[13]在1993年首次介紹了用ABTS自由基法來評價一些化合物的抗氧化活性，即根據(jù)待測化合物清除ABTS自由基引起的吸光度變化來評價其抗氧化活性。在反應(yīng)體系中，ABTS經(jīng)氧化后生成相對穩(wěn)定的藍(lán)綠色ABTS水溶性自由基。抗氧化劑與ABTS自由基反應(yīng)后使其溶液褪色，特征吸光度降低，吸光度越低，表明所檢測物質(zhì)的總抗氧化能力越強(qiáng)[14]。在測定的體積范圍內(nèi)，黃山野菊花揮發(fā)油和Vc對ABTS自由基的清除率隨著使用量的增加而增大，使用量與對ABTS自由基的清除率存在較好的量效關(guān)系。體積分?jǐn)?shù)為0.20的黃山野菊花揮發(fā)油的使用量(X)與對ABTS自由基的清除率(Y)之間的回歸方程為Y=25.321+0.330 15X(R2=0.995 6)；0.1 g/L Vc的使用量(X)與對ABTS自由基的清除率(Y)之間的回歸方程為Y=4.228+0.598 1X(R2= 0.982 0)(圖3)。盡管黃山野菊花揮發(fā)油與Vc對ABTS自由基清除過程中的變化趨勢相同，但相同條件下，黃山野菊花揮發(fā)油對ABTS自由基的清除能力仍然大于Vc對ABTS自由基的清除能力。在使用量為100 μL時，體積分?jǐn)?shù)為0.20的黃山野菊花揮發(fā)油與0.1 g/L Vc對ABTS自由基的清除率分別為58.36%，53.10%。經(jīng)計算，體積分?jǐn)?shù)為0.20的黃山野菊花揮發(fā)油和0.1 g/L Vc的IC50分別為74.751，76.529 μL。

圖2 黃山野菊花揮發(fā)油對亞硝酸鈉的清除作用 圖3 黃山野菊花揮發(fā)油對ABTS自由基的清除作用

3 結(jié)論與討論

許多疾病如炎癥、缺血-再灌入損傷、動脈硬化、老年癡呆癥和帕金森癥都與活性氧引起的生物大分子損傷有關(guān)，是自由基生成-清除體系不平衡導(dǎo)致的[15]。當(dāng)前使用抗氧化劑主要是人工合成的，如BHA，BHT等，這些抗氧化劑在提高產(chǎn)品穩(wěn)定性和保持品質(zhì)等方面效果顯著，但它們存在很多弊端，還會對人體造成潛在傷害。人們越來越傾向于天然抗氧化劑的使用。本次研究采用了3種國內(nèi)外常用的體外抗氧化活性檢驗方法(DPPH法、清除NaNO2法、ABTS法)評價了黃山野菊花揮發(fā)油的抗氧化活性。結(jié)果表明，體積分?jǐn)?shù)為0.20的黃山野菊花揮發(fā)油具有一定抗氧化活性，使用量與抗氧化活性存在量效關(guān)系。體積分?jǐn)?shù)為0.20的黃山野菊花揮發(fā)油在一定使用量范圍內(nèi)(20～100 μL)對DPPH，NaNO2，ABTS均有一定的清除作用，且清除效果與使用量有劑量效應(yīng)關(guān)系。隨著黃山野菊花揮發(fā)油使用量的增加，其清除DPPH，NaNO2，ABTS的能力逐漸增強(qiáng)，且其清除自由基的能力均高于0.1 g/L Vc對DPPH，NaNO2，ABTS的清除能力。但黃山野菊花揮發(fā)油對DPPH自由基，NaNO2，ABTS自由基的清除作用不同，其IC50分別為97.444，45.601，74.751 μL。黃山野菊花揮發(fā)油有較好的體外抗氧化活性，具有開發(fā)天然抗氧化劑的潛力。

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(責(zé)任編輯：朱寶昌)

In Vitro Antioxidant Activity of Volatile Oil fromChrysanthemumIndicumL. of Huangshan

ZHAO Xiu-ling，WENG Fei-long，LI Chang-long

(College of Life and Environment Science,Huangshan University, Huangshan Anhui,245021,China)

In vitro antioxidant activity ofφ(volatile oil)=0.20 volatile oil fromChrysanthemumIndicumL. of Huangshan was evaluated by scavenging capacity against DPPH，ABTS，sodium nitrite. The results showed that the IC50 values of scavenging capacity against DPPH，ABTS，sodium nitrite were 74.75，97.44，45.60 μL. Scavenging capacity against ABTS and DPPH were higher than that of 0.1 g/L Vc, but the scavenging capacity against sodium nitrite of volatile oil were significantly higher than that of 1 g/L BHT. The volatile oil fromChrysanthemumIndicumL.of Huangshan had good in vitro antioxidant activity. It is worth to develop for application.

ChrysanthemumIndicumL.;volatile oil;in vitro antioxidant activity

10.3969/J.ISSN.1672-7983.2015.01.011

趙秀玲(1973-)，女，講師。主要研究方向：食品功能性質(zhì)。

2013年黃山學(xué)院校級科研項目(項目編號：2013xkj002)。

2014-09-21; 修改稿收到日期: 2014-11-28

R284.1

A

1672-7983(2015)01-0057-04