SISH檢測乳腺癌HER2基因及17號染色體倍體分析

楚廣民，白睿華，張建波，孫淼淼，于慶凱

(河南省腫瘤醫(yī)院病理科 河南鄭州 450008)

人類表皮生長因子受體2(HER2)基因是人類原位基因，其過表達不僅與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，而且是評估臨床預(yù)后的重要指標［1］。免疫組化(Immunohistochemistry，IHC)診斷HER2狀態(tài)缺乏標準化的技術(shù)、試劑及客觀的評價標準。熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)診斷HER2狀態(tài)需要長時間的染色和評分及熒光顯微鏡，并且熒光染料淬滅時信號會丟失。銀增強原位雜交(silver enhanced in situ hybridization，SISH)檢測HER2基因擴增，能得到永久染色的玻片并可在亮視野中觀察判斷。根據(jù)國外研究報道，在乳腺癌中，SISH與FISH檢測HER2基因擴增的符合率達94%～99%［2-4］。本研究應(yīng)用SISH技術(shù)對90例術(shù)前均未進行放療化療的乳腺浸潤性導(dǎo)管癌手術(shù)切除標本檢測HER2基因的擴增情況，目的在于總結(jié)操作經(jīng)驗，優(yōu)化操作方法，對這項新技術(shù)的可行性進行初步評估。

1 材料與方法

1.1 材料 選取河南省腫瘤醫(yī)院2010年10月至2011年12月手術(shù)切除乳腺癌標本90例，患者術(shù)前均未接受過放療及化療。標本離體后30 min內(nèi)用10%中性緩沖甲醛液固定16～18 h，病理學(xué)檢查確診為浸潤性導(dǎo)管癌。90例標本均行IHC染色、FISH和SISH檢測HER2的蛋白表達和基因狀態(tài)。

1.2 方法

1.2.1 IHC染色:全自動IHC檢測，使用Benchmark XT全自動 IHC系統(tǒng)及其配套試劑，一抗為 Anti—HER2/neu(4B5，Ventana公司，美國)，使用UltraView DAB試劑盒，嚴格按照Roche診斷優(yōu)化程序執(zhí)行，常規(guī)封片。

1.2.2 FISH檢測:所用 PathVysion HER2DNA探針試劑盒購于VYSIS公司，蛋白酶K購于MERCK公司。熒光顯微鏡為Olympus公司BX51型號及專用的FISH圖像分析軟件。檢測步驟嚴格按照試劑盒推薦的標準程序進行。

1.2.3 SISH檢測:在Benchmark XT全自動切片染色機上進行，所用試劑購自美國Roche公司，包括INFORM HER2 DNA探針、17號染色體(Chrl7)DNA探針、Ventana uhra ViewTMSISH檢測試劑盒以及輔助試劑。操作步驟及參數(shù)設(shè)置按照操作手冊及試劑說明書。常規(guī)封片，光鏡觀察。

1.3 結(jié)果判讀

1.3.1 IHC染色評分:采用國際公認的ASCO/CAP指南推薦的評分系統(tǒng)。

1.3.2 FISH:選擇細胞核大小一致，胞核邊界完整、DAPI染色均一、細胞核無重疊、Chrl7綠色信號清晰的細胞，隨機計數(shù)至少30個癌細胞核中的雙色信號。HER2基因狀態(tài)判讀標準:HER2/Chr17比值＜1.8提示無擴增;比值＞2.2提示HER2基因擴增。若比值位于1.8～2.2之間，則 HER2基因擴增不確定。Chr17倍體判讀標準:綠色信號定位于17號染色體的著絲粒，計算綠色熒光信號為Chr17倍體情況，根據(jù)信號數(shù)目可分為單體，雙體和多體(細胞核中綠色信號＞2)。

1.3.3 SISH:HER2基因為黑色信號，Chrl7為紅色信號，其判讀標準同F(xiàn)ISH。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，進行χ2檢驗及Kappa一致性檢驗，α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 SISH與IHC和FISH法檢測HER2的結(jié)果比較 IHC檢測90例患者中，HER2蛋白表達陽性(3 +)的25例中FISH檢測23例(92%)為HER2基因擴增，SISH檢測24例(96%)為HER2基因擴增;蛋白表達不確定(2+)的19例中FISH檢測7例(36%)為HER2基因擴增，2例(10%)為基因擴增不確定，SISH檢測8例(42%)為HER2基因擴增，1例(5%)為基因擴增不確定;蛋白表達陰性(1+/0)的46例FISH檢測均為基因無擴增，SISH檢測也均為基因無擴增?？傮w符合率為96%。結(jié)果見表1。

表1 IHC、FISH與SISH方法檢測乳腺癌HER2的結(jié)果比較

2.2 FISH法檢測Chr17的結(jié)果 FISH法檢測Chr17的結(jié)果見表2。90例乳腺癌標本中，Chr17多體在IHC(3+)、(2+)、(1+/0)3組中的發(fā)生率分別為44%，26%和0.02%，其總的發(fā)生率為18%。3組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=19.36，P＜0.01)。

表2 IHC法檢測HER2蛋白與FISH法檢測Chr17的結(jié)果

2.3 HER2基因擴增與Chr17的關(guān)系 FISH法檢測Chr17結(jié)果顯示:30例HER2基因擴增的病例中Chr17多體有12例(40%);在58例HER2基因無擴增的病例中只有1例Chr17是多體(0.01%)。見表3。

表3 FISH檢測HER2基因擴增與Chr17的關(guān)系

3 討論

2007年ASCO/CAP推薦乳腺癌HER2狀態(tài)檢測可選IHC和FISH。對于多數(shù)病理科來說，IHC檢測HER2蛋白表達是常規(guī)首選，但IHC技術(shù)影響因素較多，包括抗體的選擇、抗原修復(fù)方法等。醫(yī)院間結(jié)果差異較大，存在大量假陽性或假陰性的結(jié)果，因此無法準確評估HER2基因的擴增狀況。FISH用于HER2原癌基因核酸水平的檢測具有高敏感性及穩(wěn)定性，但其熒光衰變速度快，結(jié)果難以長期保存，且需要配備昂貴的熒光顯微鏡及專用圖像分析系統(tǒng)，普及開展有一定困難。

SISH是近年發(fā)展起來的一種基因檢測新技術(shù)，通過使用先進的銀沉淀技術(shù)，能夠得到非常精確的色素信號，也是目前唯一的全自動原位雜交分析方法。作為一項新技術(shù)，SISH能被廣泛接受的前提條件是它必須與目前的“金標準”FISH有很高的符合率。2007年ASCO/CAP提出的標準是新技術(shù)檢測結(jié)果與FISH的符合率應(yīng)達到95%以上［5］。本研究結(jié)果表明SISH檢測可滿足上述條件:SISH和FISH檢測乳腺癌HER2基因擴增狀態(tài)的符合率達到96%，與文獻報道的符合率94%～99%［3，6］相近。由此可見，SISH與FISH檢測之間具有非常好的一致性，并且多個病理醫(yī)師依據(jù)HER2基因信號與Chr17信號之比對SISH檢測結(jié)果的解釋具有很好的重復(fù)性。對于疑難病例的標本，病理醫(yī)師可在多頭顯微鏡下同時觀察，逐個細胞進行討論，從而很容易達到共識。SISH還具有在光鏡下觀察就能判斷結(jié)果的優(yōu)勢，檢測信號很容易觀察?？赏瑫r觀察組織形態(tài)，而檢測耗時只是FISH檢測所需時間的一半。因此，SISH完全可以作為常規(guī)檢測技術(shù)用于乳腺癌的HER2基因擴增狀態(tài)檢測。

Chr17異常在乳腺癌中是常見的。Risio M等認為Chr17單體的患者對曲妥珠單抗治療的反應(yīng)差。Watters AD等［7］認為具有Chr17多體的患者預(yù)后不良。另外還有部分研究者認為Chr17多體性是導(dǎo)致IHC(2+和3+)但FISH陰性的主要原因。本研究中，Chr17多體的發(fā)生率在IHC3組中差異有統(tǒng)計學(xué)意義，Chr17多體的發(fā)生與HER2蛋白的過度表達有關(guān); Chr17多體在HER2基因擴增組明顯高于無擴增組，Chr17多體的發(fā)生率與HER2基因的擴增有關(guān)。由此可見Chr17多體可能與乳腺癌患者的預(yù)后有關(guān)，在評價HER2基因狀態(tài)的同時應(yīng)該考慮Chr17倍體的變化情況，從而為臨床篩選靶向藥物及選擇治療方案提供客觀、準確的依據(jù)。

［1］ 王曉蘭，姚凡，劉楠，等.FISH在乳腺癌組織HER2/neu原癌基因檢測上的應(yīng)用及其臨床意義的研究［J］.中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2008，37(5):664-666.

［2］ Dietel M，Ellis I O，Hofler H，et al.Comparison of automated silver enhanced in situ hybridization(SISH)and fluorescence ISH(FISH)for the validation of HER2 gene status in breast carcinoma according to the guidelines of the American Society of Clinical Ontology and the College of American Pathologists［J］.Virchows Arch，2007，451(1): 19-25.

［3］ Shousha S，Peston D，Amo-Takyi B，et al.Evaluation 0f automated silver-enhanced in situ hybridization(SISH)for detection of HER2 gene amplification in breast carcinoma excision and core biopsy specimens［J］.Histopathology，2009，54(2):248-253.

［4］ Papouchado B G，Myles J，Lloyd R V，et a1.Silver in situ hybridization(SISH)for determination of HER2 gene status in breast carcinoma:comparison with FISH and assessment of interobserver reproducibility［J］.Am J Surg Pathol，2010，34(6):767-776.

［5］ Wolff A C，Hammond M E，Schwartz J N，et Al.American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer［J］.J Clin Oncol，2007，25:118-145.

［6］ Carbone A，Botti G，Gloghini A，et a1.Delineation of HER2 gene status in breast carcinoma by silver in situ hybridization is reproducible among laboratories and pathologists［J］.J Mol Diagn，2008，10 (5):527-536.

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