食管鱗狀細(xì)胞癌中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C mRNA的表達(dá)及其臨床意義*

馬 俊， 魯建軍， 鄒健勇， 顧 勇， 鐘佛添

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院胸外科，廣東廣州510080)

食管癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)存在著地區(qū)、種族和病理類型的差異。我國是食管癌高發(fā)國家，其中90%以上為鱗狀細(xì)胞癌［1］。食管鱗狀細(xì)胞癌顯著的生物學(xué)特性表現(xiàn)為腫瘤早期往往出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，腫瘤侵犯黏膜下層時(shí)即可發(fā)生廣泛和跳躍性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C(vascular endothelial growth factor C，VEGF－C)是作用于淋巴上皮細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體3(vascular endothelial growth factor receptor 3，VEGFR－3)的細(xì)胞因子，VEGF－C在食管癌淋巴管形成、淋巴結(jié)侵犯和轉(zhuǎn)移中起重要作用［2］。本研究通過原位雜交法檢測(cè)VEGF－C mRNA在食管鱗狀細(xì)胞癌組織及正常食管組織中的表達(dá)，探討其表達(dá)的臨床意義。

對(duì)象和方法

1 研究對(duì)象

標(biāo)本取自中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院胸外科2009年3月至2010年2月經(jīng)手術(shù)切除的新鮮食管鱗狀細(xì)胞癌組織以及癌旁5 cm以上正常食管組織39例，切取后立即置于液氮中暫存，然后－80℃低溫冰箱中保存。所有標(biāo)本均經(jīng)臨床及病理組織學(xué)檢查確診，患者術(shù)前未行化、放療。其中男性34例，女性5例。年齡44～83歲，平均(59.9±9.64)歲。按2009年第7版食管癌國際分期，T2組9例，T3組30例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移14例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例。低分化13例，中高分化26例。

2 主要試劑

VEGF－C原位雜交試劑盒、原位雜交專用蓋玻片及原位雜交PBS購自武漢博士德生物工程有限公司，DAB顯色試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。其它生化試劑均為國產(chǎn)分析純。

3 原位雜交過程

低溫冰箱取出標(biāo)本后馬上予以固定1 h。固定液為4%多聚甲醛 +0.1 mol/L PBS(pH 7.0～7.6)，含有1/1000 DEPC。常規(guī)脫水、浸蠟、包埋。切片厚度6 μm。石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水。30%H2O21份+蒸餾水10份混合，室溫10 min以滅活內(nèi)源性酶，蒸餾水洗3次。切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶，37℃消化10 min。原位雜交用PBS洗3次×5 min。蒸餾水洗1次。用1%多聚甲醛+0.1 mol/L PBS(pH 7.2～7.6，含有1/1 000 DEPC)室溫后固定10 min。蒸餾水洗滌3次。干的雜交盒底部加20%甘油20 mL以保持濕度。按每張切片20 μL加預(yù)雜交液。恒溫箱40℃ 4 h。吸取多余液體，不洗。按每張切片20 μL雜交液，加在切片上。將原位雜交專用蓋玻片的保護(hù)膜揭開后，蓋在切片上。恒溫箱40℃雜交過夜。揭掉蓋玻片，37℃左右水溫的2× SSC洗滌5 min×2次;37℃ 0.5×SSC洗滌15 min;37℃0.2×SSC洗滌15 min×3次。滴加封閉液37℃ 30 min。甩去多余液體，不洗。滴加生物素化鼠抗地高辛37℃60 min。原位雜交用PBS洗5 min×4次。滴加SABC 37℃20 min。原位雜交用PBS洗5 min×3次。滴加生物素化過氧化物酶37℃20 min。原位雜交用PBS洗5 min×4次。使用DAB顯色試劑盒:1 mL蒸餾水加顯色劑A、B、C各1滴，混勻，加至標(biāo)本上。顯色20 min。充分水洗。蘇木素復(fù)染，充分水洗。酒精脫水，二甲苯透明，封片。觀察VEGF－C mRNA表達(dá)情況，分為陽性組和陰性組。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析并繪制生存曲線。VEGF－C mRNA陽性率的比較采用χ2檢驗(yàn)，生存率的比較采用log－rank檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 食管鱗癌組織與正常食管組織VEGF－C mRNA表達(dá)情況

VEGF－C mRNA表達(dá)陽性的細(xì)胞胞漿著色呈棕黃色，見圖1A，VEGF－C mRNA表達(dá)陰性的細(xì)胞胞漿無棕黃色著色，見圖1B。在39例食管鱗狀細(xì)胞癌組織中，28例(71.8%) VEGF－C mRNA表達(dá)陽性，正常食管組織中5例(12.8%)表達(dá)陽性。兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

Figure 1.Results of in situ hybridization for the expression of VEGF－C mRNA.A:positive group(tumor tissue); B:negative group(non－tumor tissue).圖1VEGF－C mRNA表達(dá)情況

表1 食管組織中VEGF－C mRNA表達(dá)情況Table 1 .The expression of VEGF－C mRNA in tumor tissues and non－tumor tissues(n=39)

2 食管鱗癌組織中VEGF－C mRNA表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

VEGF－C mRNA表達(dá)陽性率在T3組顯著高于T2組(80.0%vs 44.4%，P＜0.05)，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(92.9%vs 60.0%，P＜0.05)。而在年齡分組(70.6%vs 75.0%)、性別分組(68.4%vs 80.0%)及腫瘤分化程度分組(65.4%vs 84.6%)之間無顯著差異(P＞0.05)，見表2。

表2 腫瘤組織VEGF－C mRNA表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系Table 2 .Relationship between clinicopathological parameters and expression of VEGF－C mRNA in tumor tissues

3 食管鱗癌組織中VEGF－C mRNA表達(dá)情況與患者預(yù)后的關(guān)系

隨訪至死亡或2012年2月29日(以先者為準(zhǔn))，VEGFC mRNA表達(dá)陽性組患者生存率低于陰性組［46.4%(13/ 28)vs 81.8%(9/11)，P＜0.05］，見圖2。

Figure 2.Survival curves of the two groups.圖2 兩組患者的生存曲線

討論

食管鱗狀細(xì)胞癌的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移依賴腫瘤相關(guān)血管、淋巴管提供養(yǎng)分、氧氣和轉(zhuǎn)移通道，其顯著的生物學(xué)特性表現(xiàn)為腫瘤早期往往出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，腫瘤侵犯黏膜下層時(shí)即可發(fā)生廣泛和跳躍性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟、多階段、多基因的復(fù)雜過程，其中腫瘤組織的血管生成及淋巴管生成是必不可少的環(huán)節(jié)。腫瘤血管、淋巴管生成受腫瘤細(xì)胞和宿主細(xì)胞產(chǎn)生和釋放的多種血管、淋巴管生成因子和生成抑制因子共同調(diào)控。

VEGF－C是VEGF家族中的一員，是迄今為止唯一的血管、淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞刺激因子，通過其受體2(KDR)及受體3 (Flt－4)分別作用于血管和淋巴管上皮，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移［3］。VEGF－C主要通過作用于VEGFR－3受體促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，從而發(fā)揮淋巴管新生的作用而促進(jìn)腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移［4］。Duff等［5］研究表明VEGF－C mRNA表達(dá)增加在上皮惡性腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散中起重要作用。Isaka等［6］的研究顯示過量表達(dá)VEGF－C導(dǎo)致腫瘤周圍淋巴管異常增生，使腫瘤組織更易通過淋巴管轉(zhuǎn)移。VEGF－C作為新生淋巴管的重要調(diào)控因子的作用已得到共識(shí)。

近年來，通過對(duì)VEGF－C在人腫瘤中的表達(dá)及其與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系做了大量研究，表明VEGF－C表達(dá)與消化道腫瘤淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。Furudoi等［7］應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)152例進(jìn)展期結(jié)直腸癌組織的VEGF－C表達(dá)，發(fā)現(xiàn)VEGF－C表達(dá)與淋巴管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)深度有關(guān)，并用多因素分析方法證明VEGF－C表達(dá)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響5年生存率的獨(dú)立因素。對(duì)胃癌標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)VEGF－C的表達(dá)與淋巴管密度明顯相關(guān)，提示VEGF－C與胃癌淋巴管生成密切相關(guān)。此外，在鼻咽癌［8］、乳腺癌［9］、非小細(xì)胞肺癌［10］、腦膠質(zhì)瘤［11］等實(shí)體腫瘤組織中均檢測(cè)到高表達(dá)的VEGF－C mRNA，其表達(dá)明顯高于正常組織，并與淋巴管形成、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)采用原位雜交的方法檢測(cè)食管鱗癌組織及正常食管組織中VEGF－C mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)食管鱗癌中VEGF－C mRNA表達(dá)明顯高于正常食管組織，表明腫瘤組織中可能通過某些途徑促進(jìn)VEGF－C mRNA的表達(dá)。本組資料顯示VEGF－C mRNA陽性表達(dá)率與患者T分期有密切的相關(guān)性。T3分期組的VEGF－C mRNA的表達(dá)陽性率顯著高于T2分期組，提示VEGF－C與腫瘤浸潤(rùn)深度有關(guān)，與Takala等［12］的結(jié)論相符，可能與VEGF－C增強(qiáng)腫瘤侵襲能力、抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。本組資料顯示有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的VEGFC mRNA表達(dá)率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，與Tanaka等［13］的研究結(jié)果相符。提示VEGF－C可能引起腫瘤周圍淋巴管增生，或誘導(dǎo)腫瘤內(nèi)淋巴管形成，從而使腫瘤細(xì)胞通過淋巴管進(jìn)行轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的概率增大。本組數(shù)據(jù)顯示VEGF－C mRNA陽性組患者術(shù)后隨訪顯示生存率低于VEGF－C mRNA陰性組，提示VEGF－C與腫瘤預(yù)后相關(guān)，推測(cè)可能與其促進(jìn)腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移作用有關(guān)。

本組數(shù)據(jù)顯示VEGF－C mRNA的表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌浸潤(rùn)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，并影響患者術(shù)后1年生存率，提示VEGF－C作為食管鱗癌血管和淋巴管新生過程中的重要因素，有望成為治療食管鱗癌新的、理想的“生物靶點(diǎn)”。通過抑制VEGF－C及其受體的表達(dá)以及兩者的結(jié)合，阻斷VEGF－C信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制腫瘤新生血管和淋巴管，達(dá)到抑制腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的目的，有望降低食管鱗癌的淋巴轉(zhuǎn)移率，改善病人的預(yù)后。目前已有相關(guān)的藥物實(shí)驗(yàn)在進(jìn)行，并取得一定的成果［14］。

通過本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，我們推測(cè)食管鱗癌腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的VEGF－C與其受體的胞外區(qū)特異性結(jié)合后，通過空間變構(gòu)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)酪氨酸殘基自身磷酸化，并啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂與增殖，增加血管通透性，使腫瘤更易浸潤(rùn)到深部組織。同時(shí)通過受體介導(dǎo)的途徑誘導(dǎo)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、新生淋巴管形成，新生腫瘤淋巴管由于其特殊結(jié)構(gòu)，淋巴管通透性上升，腫瘤細(xì)胞就易于侵入淋巴管并形成遠(yuǎn)處淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移。但是食管鱗癌的浸潤(rùn)和淋巴轉(zhuǎn)移的發(fā)生是一個(gè)多因素參與和協(xié)同作用的結(jié)果，其機(jī)制尚未完全明了。本實(shí)驗(yàn)僅從食管鱗癌VEGF－C mRNA這一因子觀察，其結(jié)果僅能對(duì)解釋食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展與淋巴轉(zhuǎn)移的機(jī)制提供參考。準(zhǔn)確機(jī)制的闡述仍需要進(jìn)一步臨床及基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的證實(shí)。

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