針藥結合對慢性應激抑郁模型大鼠海馬腦區(qū)NGF的影響*

張 瑜，王亞軍，田永萍，侯春英，趙 學

(1.甘肅中醫(yī)學院附屬醫(yī)院，甘肅蘭州730020;2.甘肅中醫(yī)學院，甘肅蘭州730000)

抑郁癥是一種常見的情感性精神障礙，以情緒低落、思維遲緩、意志活動減退的“三低”癥狀為主癥，可伴有許多軀體癥狀，重時伴有自殺傾向，嚴重影響到患者的生活、工作能力。隨著社會競爭壓力日趨增大，抑郁癥的患病率逐年增高，該病在世界致殘病因中排名第4位，且有反復發(fā)作的特點，已成為嚴重危害人類健康的最常見的心理疾病。抑郁癥的病因與多種因素相關，目前只針對某一發(fā)病環(huán)節(jié)的抗抑郁西藥有效率也只有67%，且需長期服藥，加之毒副作用多，價格昂貴，患者服藥依從性差，反復停藥又致使病情纏綿難愈。中醫(yī)藥治療著眼于多靶點、多環(huán)節(jié)，對人體機能有著整體調節(jié)的作用，對抑郁癥的治療顯示出極大的潛力。筆者在臨床應用針藥結合方法(針灸結合西藥、針灸結合中藥)治療抑郁癥取得了較好的療效，顯示針藥結合治療具有減毒增效、患者依從性較好的優(yōu)點。目前揭示其機制的相關研究報道不多。本實驗旨在揭示針與藥的抗抑郁機理，闡明二者治療作用的互補性，以期為臨床治療抑郁癥提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動 物

SPF級 SD大鼠 70只，雄性，體質量 160～190 g，由甘肅中醫(yī)學院科研實驗中心提供。質量合格證號:SCXK(甘)2004－0006－C000182

1.2 藥品、試劑與儀器

復方逍遙散加減，方藥組成:當歸10 g、白芍10 g、柴胡12 g、茯苓10g、白術10 g、甘草3 g、生姜6 g、薄荷3 g。按照質量︰體積=1∶1進行濃縮。氯丙咪嗪，25 mg/支，湖南洞庭制藥廠產(chǎn)品，批號20050221。NGF免疫組化試劑盒、DAB試劑盒，由武漢博士德公司提供。G6805型電針儀;BH2型光學顯微鏡，日本奧林巴斯公司產(chǎn)品;BL2000圖像分析系統(tǒng)，成都泰盟科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 動物分組與模型的建立

按數(shù)字隨機表法將動物隨機分為正常組、模型組、西藥組、中藥組、電針組、電針加中藥組、電針加西藥組，每組10只。

慢性應激抑郁模型制作參閱文獻方法［1］改進。除正常組大鼠進行正常飼養(yǎng)，不予任何刺激外，其余各組給予多種不可預知的長期應激刺激制作抑郁癥模型。采用慢性應激結合孤養(yǎng)的方式進行造模，刺激包括冷水游泳(5℃，3 min)、夾尾(1.5 min)、禁水(24 h)、禁食(24 h)、電擊足底(電壓為45 V，電擊5 s，間歇5 s，共進行2 min)、晝夜顛倒(24 h)、溫箱(45℃，5 min)，每天隨機安排1種刺激方式，共進行28 d各種不同的刺激。

1.4 治療方法

給予大鼠多種不可預知的應激刺激，從8 d后開始，各治療組在給予應激刺激的同時開始治療。西藥組每天給予氯丙咪嗪2.5 ng/g，腹腔注射給藥。中藥組以復方逍遙散加減方灌胃，參照《實驗針灸學》［2］，每只動物按照動物體表劑量進行換算，給藥劑量5.76 mg/g。1 d 1次，共計21 d。實驗期間，每7 d稱量體質量1次，以便調整給藥劑量。電針組:參照《實驗針灸學》，取穴的解剖位置相當于人體的百會、印堂、三陰交(雙)，平刺進針，接G6805型電針儀，疏密波，頻率100 Hz，電壓6V，強度以引起大鼠肢體輕微抖動為宜，于每日應激刺激前進行電針，持續(xù)15 min。1 d 1次，共計21 d。電針加中藥組:先電針刺激，再進行中藥治療，方法同上。電針加西藥組:先電針刺激，再進行西藥治療，方法同上。模型組給以與針刺組同樣的抓取，但不予任何治療。

1.5 檢測指標

光鏡下觀察大鼠海馬腦區(qū)病理組織學變化，并用免疫組化法測定組織中神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)表達。于治療完成后第2天，將大鼠乙醚麻醉后開胸，升主動脈插管，剪開右心房，先灌注生理鹽水200 mL，再灌注40 g/L多聚甲醛150 mL，持續(xù)30 min;取出腦組織海馬區(qū)，以40 g/L多聚甲醛固定，于4℃冰箱保存。常規(guī)包埋組織，脫蠟，行HE染色，鏡下觀察海馬局部病理變化，然后按照試劑盒說明進行NGF免疫組化染色，并測量。每只動物取相同部位的5張切片，每張在大腦海馬的CA1、CA3、DG區(qū)分別取10個視野，在10×40倍光鏡下進行圖像分析，計算NGF平均灰度值。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件處理。計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)(x－)±標準差(s)表示，進行單因素方差分析，組間比較采用q檢驗。以P＜0.05為差別有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠海馬腦區(qū)病理組織學對比

正常組:海馬CA1、CA3區(qū)排列規(guī)則，細胞層次豐富，海馬結構清楚，神經(jīng)細胞膜清晰完整，尼氏體豐富，胞核形態(tài)正常，核仁清楚，胞體伸出多個突起，血管及間質如常。模型組:海馬CA1、CA3區(qū)神經(jīng)細胞排列欠規(guī)則，細胞層次減少，海馬結構尚清，神經(jīng)細胞膜完整，尼氏體減少，部分胞核體積減少，染色加深，核仁不清，小膠質細胞及間質未見明顯異常。經(jīng)過治療后，電針組可見CA3區(qū)神經(jīng)細胞稀疏欠規(guī)則;中藥組細胞數(shù)目有所減少;電針加中藥組、電針加西藥組見海馬CA1、CA3區(qū)神經(jīng)細胞無明顯改變，神經(jīng)細胞排列較整齊和緊密，細胞數(shù)目有所減少，但較模型組輕。

2.2 各組大鼠海馬腦區(qū)NGF免疫組化染色對比

正常組:海馬結構及齒狀回神經(jīng)細胞胞漿內(nèi)有大量棕色細顆粒，細胞排列密集，著色深，有的有較長的突起。模型組:陽性細胞數(shù)量明顯減少，且多數(shù)細胞呈空泡狀，胞漿著色很淺，海馬區(qū)及齒狀回神經(jīng)細胞胞漿內(nèi)有極少量的棕色顆粒。中藥組、電針組:細胞著色深，海馬區(qū)及齒狀回神經(jīng)細胞胞漿內(nèi)有較多棕色顆粒。電針加中藥組、電針加西藥組:細胞排列密集，層次較多，海馬區(qū)及齒狀回神經(jīng)細胞胞漿內(nèi)有多量棕色細顆粒。

2.3 治療第21 d時各組大鼠海馬腦區(qū)免疫組化灰度值對比

治療第21 d時，與正常組對比，模型組海馬CA1、CA3及DG的NGF陽性神經(jīng)元的免疫組化平均灰度值明顯升高，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。與模型組對比，各治療組海馬各區(qū)CA1、CA3、DG的NGF陽性神經(jīng)元的免疫組化平均灰度值均明顯降低，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.01或P＜0.05);中藥組和電針組CA1區(qū)的NGF陽性神經(jīng)元的免疫組化平均灰度值較正常組高，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，西藥組、電針+中藥組、電針+西藥組與正常組對比，差別無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);各治療組組間對比，差別亦無統(tǒng)計學意義。見表1。

表1 各組海馬神經(jīng)元NGF免疫組化灰度值對比 ±s

表1 各組海馬神經(jīng)元NGF免疫組化灰度值對比 ±s

注:與正常組對比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型組對比，#P＜0.05，##P＜0.01。

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3 討論

大量研究表明，慢性應激時，機體神經(jīng)—內(nèi)分泌—免疫網(wǎng)絡失衡，由于一系列的神經(jīng)生化改變可導致大腦器質性損害，而與情緒密切相關的邊緣系統(tǒng)尤其是腦海馬結構最易受到損害。海馬是學習、記憶、認知的重要腦區(qū)，也是調節(jié)應激反應并受應激影響的最重要的腦部結構之一。所以，海馬損傷可能與抑郁情緒的發(fā)生有關［3］。

本實驗觀察到:抑郁模型大鼠的海馬CA1、CA3區(qū)，神經(jīng)細胞排列欠規(guī)則，細胞層次減少，海馬結構尚清，神經(jīng)細胞膜完整，尼氏體減少，部分胞核體積減少，提示海馬區(qū)正常的神經(jīng)結構受損;抑郁組大鼠海馬神經(jīng)元NGF免疫反應陽性顆粒數(shù)目減少，著色淺淡，同正常組對比，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，提示抑郁癥大鼠海馬神經(jīng)元NGF含量降低，這與以往的研究結果類似［4－5］。提示抑郁癥的發(fā)生與海馬的神經(jīng)元損傷和海馬區(qū)的NGF功能密切相關。

中醫(yī)典籍中沒有抑郁癥的明確記載，但歷代文獻中有“郁癥”、“百合病”、“癲證”等的描述與本病臨床表現(xiàn)相似，現(xiàn)抑郁癥已明確歸屬于“郁證”范疇。中醫(yī)學認為:肝主疏泄，肝的疏泄功能具有調暢情志的作用。情志不暢，肝失疏泄，氣機郁滯，犯脾克胃，必致脾胃升降失常，氣血乏源，營血漸耗，則心失所養(yǎng)，神失所藏，五臟失和，終致精神情志活動的異常?？梢姟案斡簟笔潜静〉牟C核心;五臟皆藏神，而心主神明，為五臟六腑之大主，神之根在陽氣，腦又為“元神”之府，諸陽之會，故腦神失調是抑郁癥的主要病理;本病的病位主要在心和腦，但腦的功能隸屬于五臟，而心神受損，必然與脾、腎等多個臟腑相關。故治療上以疏肝解郁為重，但調神健脾、寧心安神亦是不可或缺的重要環(huán)節(jié)。

針刺治療情志病由來已久。心主神明，“腦為元神之府”，為精神、意識所出之所，為諸陽之會;心主血，上供于腦，血足則腦髓充盈，故心與腦息息相通。針灸治療抑郁癥就是以此為中心環(huán)節(jié)，以寧心調神理氣為治療原則，暢達氣機，心腦同治。本實驗采用的百會、印堂、三陰交，是目前臨床針灸治療抑郁癥頻率處于高位的腧穴［6］。百會位居巔頂，為督脈經(jīng)穴，督脈總督一身之陽氣，上至風府，入屬于腦，絡腎，腎生髓，腦為髓海;且督脈與肝、心、脾、腎等臟腑也均有聯(lián)系，這些臟腑經(jīng)絡同人體情志活動密切相關。故針百會可健腦益智、疏通經(jīng)絡、調暢情志、調整臟腑功能，從而恢復心腦的正常功能;印堂居額部，為經(jīng)外奇穴，具有調神醒腦之功;三陰交為足厥陰肝經(jīng)、足太陰脾經(jīng)、足少陰腎經(jīng)的交會穴，可調整肝、脾、腎功能，起到疏肝理氣、健脾調心、健腦寧神的作用。諸穴相配，氣血和順，陰陽調和，腦健神清，腦髓生化有源，以調整情志異常。

逍遙散是中醫(yī)調治情志活動異常的經(jīng)典名方，功在疏肝解郁健脾和營。本實驗結果顯示，無論是中藥逍遙散還是電針組治療后，均可見海馬區(qū)及齒狀回神經(jīng)細胞著色深，胞漿內(nèi)有較多棕色顆粒，海馬各區(qū)CA1、CA3、DG的NGF陽性神經(jīng)元的免疫組化平均灰度值均明顯升高，同模型組對比，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。此提示逍遙散和本針灸處方均可有效改善大鼠的抑郁狀態(tài)，均有升高抑郁癥大鼠海馬腦區(qū)神經(jīng)元NGF陽性表達的作用，這可能是它們治療抑郁癥的共同機制之一。

本實驗結果提示中藥、針灸治療抑郁癥與抗抑郁西藥氯丙咪嗪的療效相當，但西藥毒副作用多，病人依從性較差。針灸和中藥是簡驗效廉的方法，對于抑郁癥的治療有著積極的臨床應用價值，也將給抑郁癥患者提供更多的醫(yī)療選擇。

本實驗中，針藥結合治療兩組(電針加中藥組、電針加西藥組)均可以使大鼠海馬各區(qū)NGF的陽性表達增加，雖然與西藥、中藥組相比，海馬各區(qū)NGF的陽性表達差別沒有統(tǒng)計學意義，但電針組、中藥組治療后，CA1區(qū)NGF免疫組化染色平均灰度值尚未完全恢復到正常水平，與正常組對比差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而針藥結合組則完全恢復到正常水平。由此看出，針藥結合治療對改善海馬NGF的表達有較好的作用，可能對海馬腦區(qū)神經(jīng)元的功能具有較好的保護作用，提示針藥結合方面具有一定的治療優(yōu)勢。

有研究顯示，對實驗性抑郁癥大鼠海馬區(qū)神經(jīng)生長因子(NGF)含量減少，可通過提高腦內(nèi)神經(jīng)生長因子水平抵抗應激引起的腦組織損傷。側腦室給予神經(jīng)營養(yǎng)因子，可改善因慢性應激所引起的海馬神經(jīng)元組織學變化以及抑郁樣行為［7］。本實驗各組治療方法均能提高NGF的在海馬腦區(qū)的表達，這可能是其發(fā)揮治療作用的機制之一。本實驗由于條件所限，未能觀察針刺、中藥、電針加中藥、電針加西藥是否對NGF基因轉錄具有干預作用，此有待進一步研究。

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［5］王雪琦，由振東，趙小林，等.抑郁癥大鼠海馬和頂葉皮質神經(jīng)元NGF含量及其mRNA的表達［J］.第二軍醫(yī)大學學報，2002，23(6):590－592.

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