咪喹莫特對尖銳濕疣患者外周血白細胞介素-18表達的影響

夏衛(wèi)中，李愛萍，張 峰，王翠媚

尖銳濕疣是由人乳頭瘤病毒感染引起的生殖器等部位皮膚黏膜良性增生性疾病，是一種國內目前最常見的性傳播疾病之一［1］。白細胞介素18(IL-18)，也稱干擾素γ(IFN-γ)誘導因子，是近年發(fā)現(xiàn)的細胞因子，在激活T細胞介導免疫和清除入侵微生物中起著關鍵作用［2］，而且也是一個能夠在不同的免疫環(huán)境中調節(jié)Thl或Th2類免疫應答的細胞因子［3］。咪喹莫特膏是一種新型的小分子免疫調節(jié)劑，外用治療尖銳濕疣具有明顯的療效［4］，但其治療作用機制尚未明確。本文對咪喹莫特對尖銳濕疣患者外周血IL-18表達影響進行了探討，現(xiàn)將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 資料 患者組22例為我院2009年11月～2010年3月的門診患者，其中男12例，女10例，年齡16～36歲，平均年齡24.6歲，病程3 d～2個月。均符合尖銳濕疣診斷標準［1］。無合并其他性傳播疾病或其他自身免疫性疾病，患者入選前2個月內無系統(tǒng)性應用免疫抑制劑或皮質類固醇制劑或抗生素或中藥制劑。所有患者外用5%咪喹莫特軟膏，8 h后用清水清洗患處，去除藥物，隔日用藥1次，療程8周?；颊咧委熐昂笫占庵苎? m l。另選擇20名健康者外周血作對照組，其中男10例，女10例，年齡16～36歲，平均年齡25.3歲。

1.2 方法 (1)外周血單-核細胞的分離:患者及健康對照者外周靜脈血4 m l，加入EDTA抗凝管，PBS(pH7.4)等倍稀釋;吸取淋巴細胞分離液2～15 ml離心管中，將稀釋血液緩慢加入到分層液上，將離心管置離心機內，20℃，2 000 r/min，20 min，用毛細吸管吸取單個核細胞層，盛于另1支離心管中，用5倍體積的PBS洗2次，3 000 r/min，5 min，完全PRMI-1640定容細胞，調整細胞濃度至為5X106/m l。(2)外周血單-核細胞總RNA的提取:用Trizol－氯仿－異丙醇－乙醇法提取PBMCs總RNA。(3)引物的設計和合成:參考16sRND基因文庫設計引物，IL-18引物序列如下:FO:5’-ACCAGTAGAAGACAATTGCATCAACT-3’，RO:5’–CCAGGTTTTCATCATCTTCAGCTA－3’，引物擴增片斷長度為130bp，TaqMan Probe:5’-TGTGGCAATGAAATTTATTGACAATACGCTTTACTT-3’，由ABI 3900臺式高通量DNA合成儀合成。(4)逆轉錄反應:取4μl RNA模板作逆轉錄反應(PE9700PCR儀)，反應體系如下:5×逆轉錄buffer 4μl，上游引物(10 pM/μl)0.4μl，下游引物(10 pM/μl)0.4μl，dNTPs(25mM)0.2μl，MMLV(10 U/ μl)1μl，DEPC水10μl，總體積20μl。反應條件:37℃1 h，然后95℃3 min。(5)熒光定量PCR反應體系(熒光定量儀PE7000型PCR擴增儀擴增完成):反應體積為50μl，反應體系:5×定量PCR buffer 10μl，上游引物F1μl，下游引物R1μl，dNTPs0.5μl，熒光探針1μl，Taq酶1.5μl，cDNA 5μl，ddH2O 30μl。反應條件為:93℃ 2 min，然后93℃45 s，55℃45 s，共36個循環(huán)。反應結束后，計算待測樣本IL-18 mRNA表達量(copy/μg RNA)。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SAS 8.01 for Window統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，組間比較采用秩和檢驗。

2 結果

IL-18mRNA的表達量IL-18mRNA在尖銳濕疣外周血中治療前的表達水平明顯高于健康對照組的表達水平(t= 10.82，P＜0.001);治療后的表達水平分別明顯低于治療前的表達水平(t=10.74，P＜0.001);治療后的表達水平與正常對照者的表達水平無明顯差異(t=1.05，P＞0.05);見表1。

3 討論

表1 患者和健康對照者外周血IL-18mRNA表達(±s，拷貝/μg RNA)

表1 患者和健康對照者外周血IL-18mRNA表達(±s，拷貝/μg RNA)

組別 例數(shù)IL-18患者組: 20 22393.79±5406.89治療前 22 104942.32±22694.05治療后 22 30332.51±18674.39對照組:

IL-18具有多種生物學活性，主要由活化的巨噬細胞產生，也可由上皮細胞包括角朊細胞產生。研究表明，IL-18可激活T細胞和外周血單核細胞產生大量的干擾素γ，促進Thl類細胞因子的產生，增強NK細胞和T細胞的細胞毒性，從而增強宿主抗腫瘤及病原微生物感染的作用［5-6］。動物感染模型的研究提示IL-18可通過誘導IFN-γ產生而發(fā)揮其清除病原微生物的功能［7-8］。本研究結果顯示尖銳濕疣患者皮損和健康者皮膚均有IL-18 mRNA的表達，但尖銳濕疣患者的表達量明顯高于健康對照者，與劉國英等［9］報道的基本一致。提示在人類乳頭瘤病毒感染時，機體的抗感染免疫有一定的激活，產生IL-18抗病毒因子，這可能與病毒最終被清除有一定關系。

咪喹莫特屬于免疫調節(jié)劑，是一種干擾素誘導劑。咪喹莫特雖然對于病原微生物和腫瘤細胞無直接的殺傷作用，但因在用藥局部誘導產生炎癥反應和多種細胞因子，進而增強機體的細胞免疫活性與免疫應答，通過免疫調節(jié)發(fā)揮間接抗病毒作用［10］。有研究表明，5%咪喹莫特治療肛周和外生殖器疣療效好，安全性好，使用方便［10］，但其治療尖銳濕疣的作用機制的研究甚少。最近的研究認為咪喹莫特治療后尖銳濕疣患者體內IL-2表達水平較治療前上升，IL-10表達水平較治療前下降，提示咪喹莫特有可能通過免疫調節(jié)作用，部分糾正Th1/Th2比例失衡，改善機體的免疫功能，增強抗病毒能力［11］。本研究發(fā)現(xiàn)患者外周血中IL-18的表達明顯高于健康對照者的表達水平，患者經過咪喹莫特治療后，皮損消退，IL-18的表達降低。這些結果提示咪喹莫特能抑制尖銳濕疣患者外周血IL-18的表達，恢復患者血液IL-18表達平衡，這可能是咪喹莫特治療尖銳濕疣的作用機制之一。

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