手足口病實(shí)驗(yàn)室分型診斷的研究進(jìn)展

劉仁輝

手足口病(Hand footmouth disease，HFMD)是由多種腸道病毒引起的急性傳染病，引起HFMD的腸道病毒有20多種，主要是小RNA病毒科腸道病毒屬的一組腸道病毒，其中腸道病毒71型(EV71)及柯薩奇病毒16型(CoxA16)最常見(jiàn)，其中EV71型感染常導(dǎo)致重癥HFMD。EV71手足口病流行以來(lái)，多數(shù)患兒預(yù)后良好，但少數(shù)患兒可出現(xiàn)重癥病例，易并發(fā)無(wú)菌性腦膜炎、腦干腦炎、神經(jīng)源性肺水腫和呼吸循環(huán)衰竭導(dǎo)致患兒死亡以及出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)損害導(dǎo)致身體殘疾等.由于此病對(duì)嬰幼兒和兒童的危害主要表現(xiàn)為重型有較高的病死率和殘死率，嚴(yán)重危害兒童身體健康和生命安全，因此被喻為二十一世紀(jì)的“脊髓灰質(zhì)炎”。

我國(guó)衛(wèi)生部于2008年5月2日起，將其列為丙類(lèi)傳染病。資料表明EV71手足口病發(fā)病率在我國(guó)正逐年大幅度成倍數(shù)上升，重型手足口病和死亡人數(shù)也明顯增多。EV71變異快，存在10多個(gè)亞型，各亞型和其它腸道病毒缺少交叉免疫保護(hù)作用，因此人群普遍易感［1-4］。該病傳播途徑復(fù)雜，隱性感染者比例大，在嬰幼兒之間傳染性強(qiáng)，加之目前缺少有效的疫苗，預(yù)防措施主要是通過(guò)切斷傳播途徑如加強(qiáng)通風(fēng)、改善個(gè)人衛(wèi)生和早期的報(bào)告、隔離、診治和管理制度等，目前該病的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。EV71感染引起的手足口病在臨床表現(xiàn)上與柯薩奇病毒、?？刹《镜?0多種病毒感染所引起的手足口病難以區(qū)別.因此早期明確診斷是何種病毒感染導(dǎo)致的手足口病，對(duì)預(yù)防和控制EV71傳播，早期積極治療對(duì)減少EV71感染引起的嚴(yán)重并發(fā)癥和減少死亡病例，具有十分重要的意義。本文就手足口病實(shí)驗(yàn)室分型檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展方面內(nèi)容進(jìn)行綜述。

1 手足口病的發(fā)現(xiàn)和命名

1957年新西蘭首次報(bào)道導(dǎo)兒童出現(xiàn)以手、足、口腔等部位的皮疹、潰瘍?yōu)樘卣鞯募膊×餍校?958年在患兒糞便中分離出柯薩奇病毒(CoxAsckievirus)A16型(Cox A16)，1959年命名為HFMD。人類(lèi)腸病毒71型最早于1969年首次從加利福尼亞患有中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的手足口病嬰兒糞便標(biāo)本中分離出來(lái)的［5］，這些病毒可被培養(yǎng)在恒河猴腎臟細(xì)胞(rhesus monkey kidney cell;RhMK)及人類(lèi)胎兒雙套細(xì)胞中。經(jīng)由這些細(xì)胞培養(yǎng)后純株化病毒分析，發(fā)現(xiàn)會(huì)出現(xiàn)典型由腸病毒所致的細(xì)胞病變(cytopathetic effect;CPE)現(xiàn)象，由電子顯微鏡下觀察其形態(tài)及物理化學(xué)特性都與當(dāng)時(shí)已知的其他腸病毒類(lèi)似.但進(jìn)行中和抗體試驗(yàn)或免疫擴(kuò)散試驗(yàn)后，卻發(fā)現(xiàn)其彼此間并不會(huì)有交互作用的現(xiàn)象。因此推測(cè)當(dāng)時(shí)所發(fā)現(xiàn)的病毒為一種新型的腸病毒。鑒于這種情況，1970年研究者將該病毒視為一種新型腸病毒，命名為腸病毒71型(Human enterovirus 71，EV71)。

2 EV71病原學(xué)

2.1 EV71形態(tài)結(jié)構(gòu)及基因結(jié)構(gòu) EV71是小RNA病毒科腸道病毒屬成員。由一個(gè)非包膜病毒衣殼環(huán)繞一個(gè)核心組成，EV71的病毒顆粒為二十面體立體對(duì)稱(chēng)的球形結(jié)構(gòu)，無(wú)包膜和突起，直徑大約在24～30 nm。EV71病毒核心為7408個(gè)核苷酸的單股正鏈RNA病毒基因組，基因組中僅有一個(gè)開(kāi)放閱讀框，編碼含2194個(gè)氨基酸的多聚蛋白在其兩側(cè)為5’和3’一非編碼區(qū)(UTRs)，在3’非編碼區(qū)的末端含有一個(gè)長(zhǎng)度可變的多聚腺苷酸尾巴(poly-A)。病毒的單鏈RNA具有感染性，如果去除3’末端的多聚腺苷酸尾或基因組出現(xiàn)斷裂，感染性就會(huì)消失.該多聚蛋白可進(jìn)一步被水解成P1、P2、P33個(gè)前體蛋白，P1前體蛋白編碼VP1、VP2、VP3、VP4 4個(gè)病毒外殼蛋白;P2和P3前體蛋白編碼7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(2A～2C和3A～3D).病毒粒子的衣殼由6個(gè)亞單位構(gòu)成，后者又是由4種衣殼蛋白(VP1～VP4)拼裝成的五聚體樣結(jié)構(gòu)。4種結(jié)構(gòu)蛋白中，除VP4包埋在病毒粒子外殼的內(nèi)側(cè)與病毒核心緊密連接以外，其它3種結(jié)構(gòu)蛋白均暴露在病毒顆粒的表面，因而抗原決定簇基本上位于VP1～VP3上，病毒衣殼與病毒毒力有關(guān)，VP1作為EV71相對(duì)保守的衣殼結(jié)構(gòu)，可調(diào)節(jié)病毒吸附和脫殼，可能成為抗腸道病毒的1種蛋白［6］，VP1蛋白也是主要的病毒中和決定因子，它直接決定病毒的抗原性.VP1基因具有與病毒血清型完全對(duì)應(yīng)的遺傳多樣性［7］，由891個(gè)核苷酸組成的VP1是EV71疫苗發(fā)展的主要靶蛋白［8］。

2.2 EV71病毒的感染與復(fù)制 EV71病毒的復(fù)制發(fā)生在宿主細(xì)胞漿內(nèi)［9］，首先病毒與細(xì)胞膜表面受體相結(jié)合，然后借助細(xì)胞的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，或通過(guò)與細(xì)胞膜進(jìn)行融合進(jìn)行脫衣殼而將病毒RNA釋放進(jìn)細(xì)胞。由于宿主細(xì)胞內(nèi)缺乏EV71基因組RNA進(jìn)行復(fù)制的RNA聚合酶，所以病毒進(jìn)入細(xì)胞漿后必須首先進(jìn)行基因組的轉(zhuǎn)錄和翻譯。EV71病毒的復(fù)制與其它正鏈RNA病毒相似，首先病毒RNA作為mRNA翻譯成病毒蛋白，包括RNA復(fù)制酶，然后形成RNA的復(fù)制中間型(replicative intermediate，RI)，從而合成互補(bǔ)負(fù)鏈，而負(fù)鏈又在復(fù)制酶的催化下在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中進(jìn)一步大量合成正鏈RNA。隨著大量病毒正鏈RNA在細(xì)胞漿內(nèi)的堆積，病毒逐漸進(jìn)入子代病毒的包裝過(guò)程。該過(guò)程比較復(fù)雜，一般首先由5個(gè)未切割的P1蛋白相互凝集，P1前體蛋白切割后形成5個(gè)形狀相同的凝集體，即五聚體(pentamer);然后12個(gè)五聚體沿著一個(gè)二十面體的12個(gè)頂點(diǎn)形成前衣殼，這也即是具有接受RNA分子能力的前毒粒，所以EV71是由60個(gè)相同的亞單位組成;最后1AB經(jīng)宿主酶切割成VP4、VP2，以進(jìn)一步穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生完全成熟的子代病毒粒子。

3 實(shí)驗(yàn)室診斷

3.1 病毒分離 EV71感染診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”是細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒［10］常用的分離方法有細(xì)胞接種和乳鼠接種?；颊呒S便標(biāo)本是最常采集的標(biāo)本，其它如咽拭子或咽喉洗液、腦脊液、皰疹液或血清以及腦、肺、脾、淋巴結(jié)等組織標(biāo)本［11］。70年代中期應(yīng)用綠猴腎細(xì)胞(Vero)培養(yǎng)和新生白鼠接種成功分離病毒，近年來(lái)應(yīng)用人源細(xì)胞如W1-38、橫紋肌瘤細(xì)胞(RD)進(jìn)行病毒分離。對(duì)于所有懷疑含EV71、CA16的標(biāo)本均需接種到RD和HEp-2(來(lái)源于人喉癌上皮細(xì)胞)2種細(xì)胞系，聯(lián)合使用上述2種或更多細(xì)胞(如Vero細(xì)胞)有助于分離到更多的腸道病毒。病毒分離培養(yǎng)對(duì)流行病學(xué)分析具有重要意義，由于病毒培養(yǎng)耗時(shí)，一般需要4～15 d或更長(zhǎng)的時(shí)間，往往貽誤特異性治療，同時(shí)對(duì)診斷某些EV血清型的敏感性也欠佳，使得其對(duì)臨床診斷有一定的限制性，該方法病毒分離的敏感度也依賴(lài)于標(biāo)本的采集、類(lèi)型、質(zhì)量以及所用細(xì)胞的類(lèi)型，病毒分離培養(yǎng)對(duì)技術(shù)要求較高，費(fèi)用較貴，耗時(shí)需要，且各實(shí)驗(yàn)室分離陽(yáng)性率各不相同，屬于勞動(dòng)力復(fù)合密集型，無(wú)法滿足病毒流行期間同時(shí)處理大量樣本的實(shí)際需要.盡管其檢測(cè)靈敏度比PCR法要低且耗時(shí)較長(zhǎng)，但對(duì)于一些含有PCR抑制因素的樣品來(lái)說(shuō)，病毒分離方法也許是唯一的PCR法不能取代的檢測(cè)方法。

3.2 血清學(xué)檢測(cè) 血清學(xué)方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbnent assay，ELISA)、中和抗體檢測(cè)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(complement fixationtest，CF)等，通過(guò)對(duì)單份血或急性期和恢復(fù)期雙份血進(jìn)行抗體測(cè)定作出診斷.但EV血清型繁多，臨床使用價(jià)值有限，流行病學(xué)調(diào)查采用比較多。目前國(guó)內(nèi)有間接ELISA檢測(cè)試劑盒提供，可進(jìn)行臨床患者某些型別腸道病毒的IgM血清學(xué)檢測(cè)而進(jìn)行診斷，該方法只用急性期單份血清，對(duì)臨床早期診斷有重要價(jià)值。ELISA法快速、經(jīng)濟(jì)，應(yīng)用較為廣泛，檢測(cè)人雙份血清標(biāo)本的中和抗體滴度時(shí)通常需用急性期血清與恢復(fù)期血清滴度進(jìn)行比較，抗體滴度≥4倍增高證明病毒感染.由于從病毒感染到抗體出現(xiàn)需要一定時(shí)間，因此ELISA法用于疾病的早期診斷靈敏度不高.利用ELISA捕捉法或間接法檢測(cè)早期患者血清中的IgM和IgG抗體，是較常用的檢測(cè)指標(biāo)，ELISA法相對(duì)而言簡(jiǎn)便、快速、不需要非常專(zhuān)業(yè)的技術(shù)人員，且對(duì)實(shí)驗(yàn)室的要求也不高，適合用于普通實(shí)驗(yàn)室.但是有研究結(jié)果顯示，ELISA法的敏感性低于PCR法［12］。

手足口病抗體檢測(cè)的最常用方法目前仍是中和實(shí)驗(yàn)，該方法精確且具有型特異性。如做抗體測(cè)定，必須采集2份血清標(biāo)本。第1份(急性期)在發(fā)病時(shí)盡早采集，第2份在發(fā)病后1個(gè)月左右采集。臨床分析結(jié)果時(shí)注意:(1)如果檢測(cè)患者血清中特異性IgM抗體陽(yáng)性，或急性期與恢復(fù)期血清IgG抗體有4倍以上的升高，可為實(shí)驗(yàn)室診斷病例。(2)當(dāng)無(wú)法進(jìn)行病毒分離或得不到適用于病毒分離用的標(biāo)本時(shí)，血清學(xué)檢測(cè)可以為腸道病毒的感染提供一個(gè)間接的證據(jù)。但是，無(wú)癥狀的腸道病毒感染也是常見(jiàn)的，所以對(duì)檢測(cè)結(jié)果的解釋要慎重一些。(3)由于IgG抗體產(chǎn)生需要一定時(shí)間，而且在感染早期，抗體的濃度亦較低.血清學(xué)抗體檢測(cè)可能滯后于其他檢測(cè)判斷。

3.3 分子生物學(xué)檢測(cè)

3.3.1 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)RT-PCR PCR技術(shù)是一種敏感特異的腸道病毒快速檢測(cè)分型方法對(duì)于疾病的早期診斷及防控具有重大意義。PCR技術(shù)自問(wèn)世后即被用于檢測(cè)EV幾乎可檢出所有的血清型，與傳統(tǒng)方法相比具有較好的敏感性、特異性和較高的檢出率，由于檢測(cè)材料用量少、快速、靈敏度高且具有很高的特異性，在病毒感染的實(shí)驗(yàn)室診斷中起著越來(lái)越重要的作用。

近年來(lái)，PCR技術(shù)已成為診斷腸道病毒感染最常用的一種方法，PCR測(cè)序技術(shù)則可用于EV71病毒基因分型，可進(jìn)行大規(guī)模的分子流行病學(xué)調(diào)查。引起手足口病的病毒主要為小RNA病毒科腸道病毒屬成員，病毒核酸為RNA，在進(jìn)行病毒核酸檢測(cè)時(shí)，需首先進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，將RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后再進(jìn)行特異DNA序列的擴(kuò)增和檢測(cè)，即RT-PCR方法。應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)EV71的優(yōu)點(diǎn)是快速、方便及敏感性高。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)克服了病毒分離培養(yǎng)和血清學(xué)方法相對(duì)繁雜費(fèi)時(shí)，且在病毒流行期間無(wú)法滿足同時(shí)處理大量樣本的缺點(diǎn)，已成為腸道病毒感染快速診斷的重要手段。

3.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在傳統(tǒng)RT-PCR的方法上進(jìn)行改良的方法采用特異性標(biāo)記的熒光探針，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，使每一個(gè)循環(huán)變得“可見(jiàn)“最后通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品中的DNA起始濃度進(jìn)行定量的方法，該檢測(cè)方法已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于各種病原的檢測(cè)［13］。該方法具有不易污染，特異性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，可用于手足口病暴發(fā)疫情和臨床病例的早期高通量快速診斷。經(jīng)研究表明［14］實(shí)時(shí)熒光定量PCR法與RT-PCR陽(yáng)性和陰性符合率均為100%，表明實(shí)時(shí)熒光定量PCR法特異性與準(zhǔn)確性與RT-PCR法相當(dāng)。與RT-PCR相比，實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)和分析在完全閉管的條件下進(jìn)行，能有效防止PCR產(chǎn)物的污染，提高檢測(cè)結(jié)果的可靠性;試劑在PCR檢測(cè)儀上進(jìn)行擴(kuò)增和分析，無(wú)需電泳和紫外燈觀測(cè)等步驟，從標(biāo)本處理開(kāi)始只需要3～4 h即可完成檢測(cè)，節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間。

3.3.3 內(nèi)標(biāo)多重?zé)晒?RT-PCR采用TaqMan探針，建立含有監(jiān)控內(nèi)標(biāo)(Internal Control，IC)同時(shí)檢測(cè)EV71和CA16的多重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)方法，內(nèi)標(biāo)同步參與樣品核酸的提取，不僅能夠有效地監(jiān)控樣本中的抑制物，還能避免了操作誤差所造成的假陰性.該方法可靠性強(qiáng)，無(wú)假陰性結(jié)果，能同步檢測(cè)EV71和CA16。為了對(duì)當(dāng)前暴發(fā)的手足口病進(jìn)行快速準(zhǔn)確的檢測(cè).肖性龍等［15］研究建立了含內(nèi)標(biāo)的同時(shí)檢測(cè)EV71和CA16的多重?zé)晒釸T-PCR方法，對(duì)該方法的特異性、靈敏度等進(jìn)行評(píng)估，研究表明，該檢測(cè)方法特異性強(qiáng)，比傳統(tǒng)方法的陽(yáng)性檢測(cè)率高。另外，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，在糞便、直腸拭子、咽喉拭子樣本中，PCR抑制物存在的比例為1.8%～3.4%，表明內(nèi)標(biāo)對(duì)監(jiān)控PCR抑制物的存在具有重要作用。本方法能同時(shí)對(duì)EV71和CA16進(jìn)行快速檢測(cè)，并且靈敏度高，特異性好，由于加入了內(nèi)標(biāo)，能有效地監(jiān)控假陰性的出現(xiàn)，適合于手足口病的臨床檢測(cè).

3.3.4 異源雙鏈核酸泳動(dòng)分析(heteroduplex mobility analysis，HMA) 以EV71的5＇-NTR為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，應(yīng)用HMA分析擴(kuò)增產(chǎn)物.優(yōu)點(diǎn)是通過(guò)比較異源雙鏈核酸的泳動(dòng)模式和核酸序列，準(zhǔn)確分析感染病毒是否同一基因型，是否存在變異及變異的程度［16］。也可應(yīng)用HMA研究流行期間病毒準(zhǔn)種及優(yōu)勢(shì)株(Major varants)的變化。

3.3.5 RT-PCR聯(lián)合芯片技術(shù) 芯片技術(shù)克服了血清學(xué)方法常常不能同時(shí)準(zhǔn)確進(jìn)行多個(gè)病毒分型的缺點(diǎn)，利用它的高通量特性，能同時(shí)檢測(cè)EV71和CA16并進(jìn)行基因分型.首先需對(duì)不同腸道病毒亞型數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行精確生物分析，然后設(shè)計(jì)多個(gè)血清型特異的寡核苷酸探針進(jìn)行病毒檢測(cè)。Chen TC等［17］應(yīng)用RT-PCR聯(lián)合芯片技術(shù)檢測(cè)144例HFMD患者標(biāo)本，同時(shí)所有標(biāo)本再應(yīng)用real-time PCR分析，然后由中和實(shí)驗(yàn)證實(shí)。發(fā)現(xiàn)RT-PCR聯(lián)合芯片技術(shù)對(duì)EV71和CA16的診斷準(zhǔn)確率分別高達(dá)92.0%和95.8%。提示這個(gè)高度敏感的芯片基礎(chǔ)的檢測(cè)有望成為未來(lái)EV71和CA16感染的臨床診斷方法。

綜上所述，病毒分離鑒定方法繁雜費(fèi)時(shí)，血清學(xué)檢測(cè)方法靈敏度不高，PCR法尤其是多重RT-PCR法靈敏度高，特異性好可靠性強(qiáng)，對(duì)于疾病的早期診斷及防控有重大意義，在疫情暴發(fā)時(shí)，為了提高檢測(cè)速度和準(zhǔn)確性，目前多使用PCR方法。雖然PCR法優(yōu)點(diǎn)很多，仍無(wú)法取代傳統(tǒng)的病毒分離鑒定方法，而且PCR法需要昂貴的儀器設(shè)備，檢測(cè)試劑也比前2種檢測(cè)方法成本高，對(duì)于基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)來(lái)說(shuō)難以推廣使用，因此今后需要進(jìn)一步完善手足口病原體檢測(cè)技術(shù)，特別是快速、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單、成本低廉的檢測(cè)技術(shù)。

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