微擬球藻原生質(zhì)體制備與再生

馬曉磊,張 琳,楊官品,朱葆華,潘克厚

(1.中國海洋大學(xué) 海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 應(yīng)用微藻生物學(xué)研究室,山東 青島 266003;2.中國海洋大學(xué) 海洋生命學(xué)院,山東 青島 266003)

隨著陸地資源的日益匱乏,開發(fā)和利用海洋,從海洋生物資源中索要食品、藥品和能源已成為人們的共識,也是研究者的研究重點(diǎn)和熱點(diǎn)。海洋微藻是海洋生態(tài)系統(tǒng)中重要的初級生產(chǎn)者,種類繁多,數(shù)量龐大,尤其是一些經(jīng)濟(jì)微藻已經(jīng)成功地為人類提供了豐富的資源。但是,自然資源的開發(fā)在一些研究和應(yīng)用領(lǐng)域已經(jīng)不能滿足人類的需求,隨著基因工程技術(shù)與手段的成熟與開發(fā),通過對海洋微藻進(jìn)行基因工程操作來研究和開發(fā)微藻已成為生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品和選育藻種的重要手段。但相對于高等植物和大型藻,微藻基因工程改造才剛剛起步,其中微藻原生質(zhì)體的制備是基礎(chǔ)。本文旨在尋求一種高效簡便的海洋微藻原生質(zhì)體制備和觀察方法,從而為在微藻中進(jìn)行基因工程操作奠定基礎(chǔ)。

微擬球藻(Nannochloropsis oculata)是單細(xì)胞真胞藻,屬真眼點(diǎn)藻綱,長2～5 μm[1-3],廣泛分布于海水、淡水中。它不僅被廣泛用于水產(chǎn)動物的餌料[4],還是許多高附加值產(chǎn)品的重要來源,如蛋白、色素、多不飽和脂肪酸等[5],是一個具有較高經(jīng)濟(jì)價值的海洋藻種,也是進(jìn)行遺傳育種改造的良好材料。本研究在 Chen等[8]方法的基礎(chǔ)上,綜合考慮酶處理時間和初始細(xì)胞密度兩個因子,選取半纖維素酶(Hemicellulase)和崩潰酶(Driselase)混合液制備原生質(zhì)體。同時將原生質(zhì)體細(xì)胞染色后于熒光顯微鏡下觀察拍照,并進(jìn)行了原生質(zhì)體細(xì)胞的再生實(shí)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

微擬球藻培養(yǎng)基母液配制使用的生化試劑均由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。光照培養(yǎng)箱購自南京金恒實(shí)驗(yàn)儀器廠。

制備原生質(zhì)體所用半纖維素酶(Hemicellulase)和崩潰酶(Driselase)以及原生質(zhì)體染料 Calcofluor White均購自美國Sigma公司。

再生培養(yǎng)基：在新鮮 f/2海水培養(yǎng)基中添加滲透壓穩(wěn)定劑(0.2M KCl溶液)和原生質(zhì)體膜穩(wěn)定劑(0.1% CaC12),固體培養(yǎng)基另加 1.0%～1.2% 瓊脂制備。

1.2 藻種培養(yǎng)

微擬球藻(Nannochloropsis oculata)購于澳大利亞微藻種質(zhì)庫(Australian CSIRO Collection of Living Microalgae,http：//www.cmar.csiro.au/microalgae),編號為CS-179。

培養(yǎng)條件：選用青島近海海水,經(jīng)0.4 μm 濾膜過濾后高壓蒸汽滅菌。培養(yǎng)基為新鮮f/2海水培養(yǎng)基[6-7],pH 為 7.8,培養(yǎng)溫度 25°C±1℃,鹽度 30‰,70 μmol/(s·m2)光照連續(xù)培養(yǎng),光暗比為 12h：12h。培養(yǎng)容器為三角燒瓶,置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 原生質(zhì)體的制備

1.3.1 藻細(xì)胞的預(yù)處理

取培養(yǎng)至指數(shù)生長期的藻細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行計(jì)數(shù),在8 000 r/min下離心10 min收集藻細(xì)胞,用500 μL新鮮的f/2海水培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞2～5次,保證細(xì)胞表面無營養(yǎng)鹽和其他雜質(zhì)以減少對原生質(zhì)體制備的影響,再重懸于500 μL新鮮的f/2培養(yǎng)基中。

1.3.2 原生質(zhì)體的制備方法

微擬球藻原生質(zhì)體的制備在酶處理液的選擇上參照Chen等[8]文獻(xiàn)。實(shí)驗(yàn)選取處于指數(shù)生長期的藻細(xì)胞,在500 μL 密度為 1×107cells/mL,2×107cells/mL,3×107cells/mL 的藻細(xì)胞液中加入終濃度為4%半纖維素酶和2%崩潰酶溶液,調(diào)pH為5.0,用錫箔紙包被,保證嚴(yán)格避光,于搖床上進(jìn)行80 r/min,37℃ 孵育,分別在酶處理0.5,1,2,3,3.5,4,4.5 h 7個時間點(diǎn)取樣,用Calcofluor White染料進(jìn)行染色后觀察原生質(zhì)體制備情況。對同一視野分別在可見光和熒光激發(fā)下進(jìn)行觀察拍照,每次取樣至少拍攝三個視野,計(jì)算酶處理不同時間不同密度藻細(xì)胞原生質(zhì)體的制備率。計(jì)算公式如下：

1.3.3 原生質(zhì)體的顯微觀察

按照Calcofluor White染料的使用說明[9]進(jìn)行原生質(zhì)體顯微觀察樣品的制備：取 20 μL制備的原生質(zhì)體細(xì)胞于250 μL PCR管中,加入10 μL Calcofluor White染料和10 μL 10% KOH溶液,室溫孵育 1 min以上,然后置于熒光顯微鏡在藍(lán)光(波長范圍為300～400 nm)激發(fā)下觀察。

1.3.4 原生質(zhì)體細(xì)胞的再生

分別取7個時間點(diǎn)酶處理樣品100 μL原生質(zhì)體細(xì)胞以1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min收集,用500 μL新鮮的 f/2海水培養(yǎng)基輕輕重懸沖洗兩次,再加入5 mL新鮮的f/2海水培養(yǎng)基,在200 r/min,28℃培養(yǎng)3～5 d。離心收集后重懸于20 μL新鮮的f/2海水培養(yǎng)基中,均勻涂布于再生培養(yǎng)基平板上,于 25℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每個樣品設(shè)置3個重復(fù)。

1.3.5 原生質(zhì)體再生率的計(jì)算

取100 μL酶處理后的原生質(zhì)體懸液,分別使用低滲溶液(無菌水)和高滲溶液(0.2 mol/L KCl溶液)進(jìn)行重懸處理,靜置60 min后混勻取樣用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。同時,將無菌水和高滲溶液稀釋后的懸液分別接入低滲平板和再生平板,置于 28℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),長出藻落后計(jì)數(shù),計(jì)數(shù)方法參照王明茲等[10]的方法。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 不同酶處理時間和細(xì)胞密度對原生質(zhì)體制備率的影響

對不同密度藻細(xì)胞(1×107,2×107,3×107cells/mL)進(jìn)行不同酶處理時間,統(tǒng)計(jì) 7個時間點(diǎn)取樣的原生質(zhì)體細(xì)胞制備率如圖1所示。發(fā)現(xiàn)對同一密度藻細(xì)胞處理1～3 h內(nèi)原生質(zhì)體制備率較高,并且在這3個時間點(diǎn)上相差不大。但是酶處理時間小于0.5 h或者大于3 h制備率都會下降。酶處理時間是影響原生質(zhì)體制備率的一個重要因子?？紤]到酶處理時間過長會對原生質(zhì)的復(fù)壁產(chǎn)生影響,因此本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為適宜選用的酶處理時間為1 h。

對不同密度藻細(xì)胞進(jìn)行酶處理相同時間比較發(fā)現(xiàn),高密度的藻細(xì)胞要比低密度的藻細(xì)胞制備率較高,見圖1。顯微鏡下觀察不同密度藻細(xì)胞原生質(zhì)體細(xì)胞酶處理1 h后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞比較完整,且視野內(nèi)沒有出現(xiàn)藻細(xì)胞碎片。本實(shí)驗(yàn)選細(xì)胞密度為可能對2×107cells/mL進(jìn)行原生質(zhì)體制備。

不同的藻細(xì)胞密度和不同的酶處理時間都是制約原生質(zhì)體制備率的關(guān)鍵因子。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對同一細(xì)胞密度的藻細(xì)胞,酶處理時間過短或者過長都會降低原生質(zhì)體的制備率,因此制備原生質(zhì)體時必須選取合適的處理時間。酶處理時間短制備率低可能是因?yàn)槊阜磻?yīng)時間不夠充分,來不及將更多的藻細(xì)胞制備成原生質(zhì)體;而延長處理時間可能使已經(jīng)制備出的原生質(zhì)體發(fā)生破裂導(dǎo)致原生質(zhì)體制備率降低。因此,本實(shí)驗(yàn)建議選取的酶處理時間為1 h。

圖1 不同細(xì)胞密度藻細(xì)胞進(jìn)行酶處理不同時間原生質(zhì)體的制備率Fig.1 Treatment time and different densities on the efficiency of protoplast preparation by enzym digestion

與 Chen等[8]的實(shí)驗(yàn)相比較,本研究進(jìn)行了藻細(xì)胞密度對原生質(zhì)體制備率的影響的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)證明不同密度藻細(xì)胞原生質(zhì)體制備率也不同,在一定范圍內(nèi),原生質(zhì)體的制備率隨著細(xì)胞密度的增加而增加。當(dāng)初始藻細(xì)胞密度達(dá)為2×107cells/mL,原生質(zhì)體的制備率接近 90%。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與橢圓小球藻(Chlorella ellipsoidea)原生質(zhì)體制備率相一致[11],推測可能是藻細(xì)胞密度高,相互之間接觸比較頻繁,有利于酶混合液的消化作用或者是酶混合液在細(xì)胞密度高的反應(yīng)體系中能充分發(fā)揮出其活性。因此,為提高原生質(zhì)體制備率,保持較高的初始藻細(xì)胞密度是十分必要的。

對原生質(zhì)體制備后進(jìn)行Calcofluor White染料染色,該染料綁定到細(xì)胞壁上的纖維素和幾丁質(zhì),在顯微鏡下能在300～440 nm波長光激發(fā)下發(fā)出熒光,圖2為原生質(zhì)體制備后于熒光顯微鏡下拍攝照片,熒光顯示的是細(xì)胞壁纖維素移除情況。

2.2 原生質(zhì)體細(xì)胞的再生

綜合考慮酶處理時間和初始細(xì)胞密度兩個影響因子,選取初始密度為2×107cells/mL的藻細(xì)胞進(jìn)行酶處理1 h后進(jìn)行原生質(zhì)體平板再生實(shí)驗(yàn),以觀察原生質(zhì)體再生情況。取復(fù)蘇3～5 d的原生質(zhì)體細(xì)胞和稀釋10倍后的細(xì)胞分別同時進(jìn)行高滲和低滲平板培養(yǎng)再生。培養(yǎng)至第12 d原生質(zhì)體在再生培養(yǎng)基上生長情況如圖3所示,再生平板培養(yǎng)基上能觀察到單個的藻落,這說明酶處理法制備的原生質(zhì)體是可以再生的,取再生細(xì)胞在顯微鏡下鏡檢發(fā)現(xiàn)與未處理的藻細(xì)胞從形態(tài)上面未觀察到差異。但是在低滲平板上培養(yǎng)的原生質(zhì)體在培養(yǎng)至第4個周后仍然觀察不到單藻落,這也說明酶處理法獲得的原生質(zhì)體制備率高。

圖2 藻細(xì)胞制備原生質(zhì)體染色后熒光照片F(xiàn)ig.2 The fluorescence microscopy photos of the prepared protoplast

將再生平板上的單藻落轉(zhuǎn)入新鮮的f/2海水培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),從細(xì)胞密度為2×107cells/mL開始計(jì)數(shù),觀察藻細(xì)胞生長速率,如圖4所示。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),原生質(zhì)體細(xì)胞生長趨勢與非原生質(zhì)體生長一致。

2.3 原生質(zhì)體平板再生率統(tǒng)計(jì)

原生質(zhì)體細(xì)胞經(jīng)過低滲溶液處理后將會破碎失去再生能力,只有未被制備成原生質(zhì)體的藻細(xì)胞才可以在低滲平板上進(jìn)行生長;而高滲溶液則能保持原生質(zhì)體的活力,繼續(xù)在高滲平板上培養(yǎng)可再生。對不同初始細(xì)胞密度藻細(xì)胞制備的原生質(zhì)體進(jìn)行再生率的統(tǒng)計(jì)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)至第12 d后再生培養(yǎng)平板上可觀察到單個藻落,繼續(xù)培養(yǎng)至 4周后再生平板上長出大量藻落,而低滲平板即使在培養(yǎng)至 4周之后依然觀察不到藻細(xì)胞。這說明用酶處理的方法制備微擬球藻原生質(zhì)體再生率較高。

圖3 不同密度藻細(xì)胞原生質(zhì)體再生平板再生情況Fig.3 The regeneration of protoplasts with different densities

圖4 原生質(zhì)體與野生型藻細(xì)胞生長Fig.4 The growth of protoplasts and wild algal cells

3 小結(jié)

海藻基因工程發(fā)展緩慢主要是因?yàn)槠湓|(zhì)體的制備不能通過高等植物標(biāo)準(zhǔn)的制備方法獲得[12]。近年來,通過消化細(xì)胞壁混合酶液進(jìn)行微藻原生質(zhì)體的制備取得了較大的進(jìn)展。綠藻原生質(zhì)體的制備已經(jīng)通過商品化的纖維素酶和果膠酶獲得成功[12-13],紅藻和褐藻細(xì)胞壁中因?yàn)楹胁煌诰G藻的多糖,其原生質(zhì)體則是通過來自于海洋動物和細(xì)菌的酶來處理[12,15]。微擬球藻在制備原生質(zhì)體時選取了四種酶,纖維素酶,半纖維素酶,果膠酶和崩潰酶,通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)終濃度為 4%半纖維素酶和 2%崩潰酶的酶混合液對微擬球藻原生質(zhì)體的制備率最高[8]。將制備的原生質(zhì)體和野生型藻細(xì)胞進(jìn)行生長情況進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)兩者生長趨勢一致。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果證明,4%半纖維素酶和 2%崩潰酶的酶混合液消化細(xì)胞密度為2×107cells/mL的微擬球藻1 h,原生質(zhì)體制備率和再生率都較高,生長趨勢與野生型細(xì)胞一致,為制備該藻原生質(zhì)體的最優(yōu)條件。

本實(shí)驗(yàn)綜合考慮了酶混合液處理時間和原生質(zhì)體制備的初始細(xì)胞密度兩個因子進(jìn)行實(shí)驗(yàn),并進(jìn)行了微擬球藻原生質(zhì)體細(xì)胞的再生研究,證明采用商品化的酶混合液進(jìn)行微擬球藻原生質(zhì)體的制備是可行的,這為下一步對微擬球藻進(jìn)行基因工程操作奠定了基礎(chǔ),也為其他海洋微藻原生質(zhì)體的制備提供了理論依據(jù)。

[1]Hibberd D J.Notes on the taxonomy and nomenclature of the algal classes Eustigmatophyceae and Tribophyceae (synonym Xanthophyceae) [J].Botanical journal of the linnean society,1981,82：93-119.

[2]Maruyama I,Nakamura T,Matsubayashi T,et al.Identification of the alga known as ‘marine Chlorella’ as a member of the Eustigmatophyceae [J].Japanese journal of Phycology,1986, 34：319-325.

[3]Hu H,Gao K.Optimization of growth and fatty acid composition of a unicellular marine picoplankton,Nannochloropsissp.,with enriched carbon sources[J].Biotechnology Letters,2003,25：421-425.

[4]Apt K E,Behrens P W.Commerical developments in microalgal biotechnology [J].Journal of phycology,1999,35：215-226.

[5]Fogg G E.Some comments on picoplankton and its importance in the pelagic ecosystem [J].Aquatic Microbial Ecology,1995,9：33-39.

[6]Guillard R R L,Ryther J H.Studies of marine planktonic diatoms.I.Cyclotella nanaHustedt andDetonula confervacea. Cleve[J].Canadian Journal of Microbiology,1962,8：229-239.

[7]Guillard R R L.Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates[M]// Smith W L,Chanley M H.Culture of Marine Invertebrate Animals.New York,USA：Plenum Press,1975：26-60.

[8]Chen H L,Li S S,Huang R.Conditional production of a functional fish growth hormone in the transgenic line ofNannochloropsis oculata(Eustigmatophyceae) [J].Journal of Phycology,2008,44：768-776.

[9]Harrington B J,Hageage G J.Calcofluor White：A Review of its Uses and Applications in Clinical Mycology and Parasitology [J].Laboratory medicine,2003,5(34)：361-367.

[10]王明茲,王世鋒,施巧琴,等.紫球藻原生質(zhì)體再生育種[J].福建師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2008,23(1)：65-69.

[11]Kim D H,Kim Y T,Cho J J,et al.Stable integration and functional expression of flounder growth hormone gene in transformed microalga,Chlorella ellipsoidea[J].Marine Biotechnology,2002,4：63-73.

[12]Saga N,Sanbonsuga Y.Tissue culture and genetic engineering for seaweed aquaculture[J].NOAA Technical Reports NMFS,1988,70：47-54.

[13]Fujimura T,Kawai T,Shiga M,et al.Regeneration of protoplasts into complete thalli in the marine green algaUlva pertusa[J].Nippon Suisan Gakkaishi,1989, 55：1353-1359.

[14]Saga N,Kudo T.Isolation and culture of protoplasts from the marine green algaMonostroma angicava[J].J ournal of Applied Phycology,1989,1：25-30.

[15]Cheney D P,Mar E,Saga N,et al.Protoplast isolation and cell division in the agar-producing seaweedGracilaria (Rhodophyta)[J].Journal of Phycology,1986, 22：238-243.