新牧1號苜蓿兩個抗逆相關基因啟動子的克隆及分析

楊云堯，任燕萍，蘇豫梅，陳全家，張 博，張 樺

(1．新疆農業(yè)大學農業(yè)生物技術重點實驗室 新疆農業(yè)大學農學院，新疆 烏魯木齊 830052；2．新疆草地資源與生態(tài)重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830052)

從抗逆性較強的新牧1號苜蓿(MedicagovariaXinmu-1)中成功克隆得到了兩個抗逆相關基因MvNHX1(NCBI登錄號：EU375310)和MvDREB1(NCBI登錄號：GU073286)。Na+/H+逆向轉運蛋白合成基因(NHX)會在外界環(huán)境的Na+濃度提高時，合成Na+/H+逆向轉運蛋白，然后將Na+轉運到液泡中，實現區(qū)隔化，從而減少細胞質中的Na+濃度[1-2]；DREB1蛋白是植物體內一種非常重要的轉錄因子，它可誘導一系列非生物逆境相關基因表達，研究表明，轉DREB1基因可以改良轉基因植株逆境耐受性[3-4]。但是，在植物基因工程中，外源基因上游大量使用的是組成型啟動子，如CaMV35S啟動子，組成型啟動子調控的下游基因表達沒有時空的特異性，在植物的任何生長發(fā)育階段和組織中都正常表達，這會造成細胞代謝負荷而影響植物的長勢和產量。目前，因為一些誘導型啟動子可以有效地調控下游基因的表達，如rd29A啟動子，所以能夠更好地降低轉基因植物體內積累的外源蛋白對其自身造成的傷害。Kasuga等[5]將rd29A：：DREB1A和35S：：DREB1A轉入煙草(Nicotianatabacum)后，與非轉基因煙草植株相比，轉35S：：DREB1A基因煙草的生長情況明顯滯后；但是轉rd29A：：DREB1A基因煙草植株的抗逆性明顯增強。Pellegrineschi等[6]用脅迫誘導型啟動子rd29A驅動DREB1A/CBF3的表達，使轉基因小麥(Triticumaestivum)的抗旱性得到提高，并且沒有出現明顯的畸形。至今能夠用于轉基因研究的誘導型啟動子仍然不多。所以，對于新的抗逆相關啟動子的克隆、各元件與轉錄因子之間相互作用以及順式作用元件具體序列的確定的研究是非常重要的。因此，對兩種類型的抗逆相關基因MvNHX1和MvDREB1啟動子進行克隆并分析，可有助于研究抗逆基因表達調控的分子機制，也可進一步利用MvNHX1和MvDREB1基因啟動子驅動抗逆基因在轉基因植物中進行表達。這對于了解植物的抗逆機制和提高作物的抗逆性有重要的意義。

1 材料與方法

1.1植物材料 試驗中所用新牧1號苜蓿是由新疆農業(yè)大學草地資源與生態(tài)重點實驗室提供。

1.2主要試劑 Plant Genomic DNA Kit、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DH5α感受態(tài)細胞和DNA Marker購自天根生化科技有限公司，引物由華大基因合成，pMD19-T載體試劑盒、TRNzol總RNA提取試劑、SYBR Premix Ex TaqTM和染色體步移試劑盒等購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3試驗方法 根據新疆農業(yè)大學農業(yè)生物技術重點實驗室已克隆的兩個基因：新牧1號苜蓿Na+/H+逆向轉運蛋白基因(MvNHX1)和DREB1轉錄因子基因(MvDREB1)的基因序列，分別設計引物(表1)。

表1 啟動子克隆及熒光定量PCR中所用引物序列Table 1 Primers used for real-time PCR and promoter cloning

1.3.1實時熒光定量分析MvNHX1和MvDREB1基因在鹽脅迫下的表達情況 用150 mmol·L-1NaCl對新牧1號苜蓿幼苗進行脅迫后，分別在0、1、3、6、12和24 h采取葉片樣品并提取總RNA，利用紫外分光光度法測得各脅迫時間的總RNA濃度以定量總RNA，且分別反轉錄得到cDNA，最后根據在GenBank中已登錄的苜蓿微管蛋白基因(EU664318)為內參，按TAKARA熒光定量試劑盒說明書所述進行Real-time PCR。采用相對定量2-△△Ct法計算MvNHX1和MvDREB1基因在鹽脅迫下的表達量[7]。

1.3.2MvNHX1和MvDREB1基因啟動子的克隆 新牧1號苜蓿發(fā)芽10 d后，用天根植物基因組DNA提取試劑盒方法提取新牧1號苜蓿總DNA。用設計好的兩對引物按照Geneme walking kit說明書各進行3次巢式PCR[8-9]。

第1輪PCR反應：PCR擴增體系為基因組DNA 1 μg，dNTP(mixture,2.5 mmol·L-1each)8 μL，10×LA PCR Buffer 5 μL，LA Taq酶(5 U·μL-1)0.5 μL，P1 Primer 1 μL，AP1 Primer 1 μL，加去離子水補足50 μL。PCR程序為94 ℃ 1 min，98 ℃ 1 min；運行94 ℃變性30 s，65 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，循環(huán)5次；然后進行步驟1：94 ℃ 30 s，25 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min；步驟2：94 ℃變性30 s，65 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min；步驟3：94 ℃變性30 s，65 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min；步驟4：94 ℃ 30 s，44 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，4個步驟共循環(huán)15次；最后72 ℃ 10 min。

第2輪PCR反應：PCR擴增體系為0.01×第1次PCR反應液1 μL，dNTP(mixture，2.5 mmol·L-1each)8 μL，10×LA PCR Buffer 5 μL，P2 Primer 1 μL，AP1 Primer 1 μL，LA Taq酶(5 U·μL-1)0.5 μL，加去離子水補足50 μL。PCR程序為第1輪PCR反應的步驟2～4，3個步驟共循環(huán)15次；最后72 ℃ 10 min。

第3輪PCR反應：PCR擴增體系為0.01×第2次PCR反應液1 μL，dNTP(mixture， 2.5 mmol·L-1each)8 μL，10×LA PCR Buffer 5 μL， P3 Primer 1 μL，AP1 Primer 1 μL，LA Taq酶(5 U·μL-1)0.5 μL，加去離子水補足50 μL。PCR程序同第2輪PCR反應。

瓊脂糖電泳檢測后回收目的條帶，回收及后續(xù)的連接、轉化及酶切驗證的具體步驟參照試劑盒說明書。篩選兩個基因啟動子的陽性克隆送華大基因測序[10-11]。

2 結果與分析

2.1MvNHX1和MvDREB1基因在鹽脅迫下的表達情況 在鹽脅迫0、1、3、6、12、24 h后，MvNHX1基因的平均相對表達量分別為2.17%、4.05%、12.15%、9.68%、32.07%和47.33%(圖1)。這說明MvNHX1基因的表達量在鹽脅迫后均上調，但在6 h時表達量有所降低。熒光定量PCR結果表明，在前6 h，MvNHX1的表達量上升并不明顯，但6 h后，MvNHX1表達上升極為明顯。脅迫24 h后的表達量是脅迫前的21.8倍，這說明MvNHX1受鹽脅迫誘導后上調表達幅度較大。而MvDREB1基因在不同時間鹽脅迫后，相對表達量均維持較低水平，基本在1%以下，0與24 h的相對表達均在0.3%左右，這表明MvDREB1基因表達量在鹽脅迫前后基本沒有變化。

圖1 MvNHX1基因和MvDREB1基因在不同脅迫時間的表達Fig.1 Expression of MvNHX1 and MvDREB1 genes in different stress time

2.2新牧1號苜蓿抗逆相關基因啟動子的克隆 用設計好的兩對引物對新牧1號苜蓿的基因組DNA進行3輪PCR后，分別選取兩組第3輪PCR結果(圖2)中最亮的條帶即第3泳道的1 500 bp左右大小的條帶和第6泳道位于750 bp左右大小的條帶進行回收。

圖2 MvNHX1、MvDREB1啟動子的3次PCR結果Fig.2 Three times’ PCR results of promoters of MvNHX1 and MvDREB1

將回收得到的兩條帶分別按pMD19-T載體試劑盒說明書和DH5α感受態(tài)細胞操作說明書進行連接、轉化，篩選陽性克隆送華大基因測序[12]。

2.3MvNHX1和MvDREB1基因啟動子的序列分析 綜合利用plantCARE(http:// bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)和PLACE(http:// www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalup.html)兩個啟動子在線分析軟件對測序成功的兩條啟動子序列進行分析[13]。

MvDREB1啟動子克隆得到的片段經在線綜合分析后(圖3)發(fā)現，MvDREB1啟動子序列位于該基因轉錄起始位點的上游，大小為778 bp,屬于RNA聚合酶Ⅱ型啟動子，片段中含有6個TATA序列保守區(qū)；含有4個GATA框；含有7個CAAT框等通用啟動子元件，并且還含有5個MYC元件(參與低溫和脫水反應，是與低溫調節(jié)有關的轉錄因子 ICE1等的識別位點[14])。

MvNHX1啟動子克隆得到的片段經綜合分析后(圖4)發(fā)現，MvNHX1啟動子序列位于該基因轉錄起始位點上游，全長1 655 bp，MvNHX1啟動子含有17個CAAT框、4個TATA框核心啟動子元件、1個MYC元件和6個GATA框等植物啟動子中存在的通用啟動子元件，屬于RNA聚合酶Ⅱ型啟動子。而且，還含有2個富含TC的重復區(qū)作為逆境反應的應答元件，4個G框作為光調控的作用元件等。

3 討論與結論

由熒光定量結果可知，隨著鹽脅迫時間的延長，MvNHX1基因的相對表達量總體上呈上升趨勢，且自6 h后，其相對表達量上升更加明顯。當鹽脅迫時間為6 h時，其相對表達量與3 h的相比雖有所下降，但相比協(xié)迫前表達上調。產生這一現象的原因可能是由于6 h是新牧1號苜蓿MvNHX1基因耐鹽應答機制的調整階段，也可能是由品種自身的耐鹽差異性引起的[15]。DREB轉錄因子作為AP2/EREBP轉錄因子家族的重要成員之一，也具有這個家族特點，就是家族成員都存在一個保守的DNA結合區(qū)——AP2/EREBP區(qū)。其中EREBP亞家族主要是調節(jié)植物對高鹽、干旱、低溫、病原及激素等的分子應答反應。EREBP亞家族中的DREB類轉錄因子可激活一系列的抗逆功能基因的表達，提高植株的抗逆性[16]，在植物抗逆過程中起到重要作用。新牧一號雜花苜蓿MvDREB1基因與MvNHX1基因相比在鹽脅迫后上調表達并不明顯，相對表達量都很低，表明該基因與苜蓿的耐鹽性并不相關，而后續(xù)的啟動子序列分析結果也顯示MvDREB1基因在鹽脅迫表達順式作用元件的數量上也比MvNHX1基因少很多。

圖3 MvDREB1啟動子序列和結構Fig.3 The sequence and structure of MvDREB1 promoter

本研究的克隆和分析結果表明，MvNHX1和MvDREB1基因啟動子均屬于RNA聚合酶Ⅱ型啟動子，都具有真核生物典型的核心啟動子區(qū)，含有GATA框、CAAT框和TATA框等通用啟動子元件，而且也都含有逆境反應的應答元件和光調控的作用元件等各種轉錄調控相關的順式作用元件。

MvNHX1和MvDREB1基因啟動子序列分析表明：MvNHX1基因啟動子比MvDREB1基因啟動子多出10個CAAT框，由于CAAT框是一種很強的熱誘導表達啟動子中的順式作用元件，能夠與HSE(heat shock response element)或STREs(stress response elements)等其他熱誘導啟動子中的順式作用元件共同作用誘導產生一些能夠在高溫下保護植物的熱激蛋白，所以相對于MvDREB1啟動子，MvNHX1啟動子更可能會在高溫時誘導下游基因表達；而MvDREB1啟動子中MYC元件的數量比MvNHX1啟動子要高出4個，MYC是與低溫調節(jié)有關的轉錄因子ICE1等的識別位點，所以MYC的大量存在能更多的在低溫下誘導基因的表達，因此MvDREB1基因啟動子相對MvNHX1啟動子可能使下游基因在低溫條件下更好的表達；同時兩種基因啟動子中都含有的DRE(TACCGCACAT，脫水響應元件)、G框、TC重復區(qū)等水分誘導順式作用元件，這些順式作用元件的存在使得這兩種啟動子在干旱、脫水的環(huán)境下都可能會啟動各自的基因表達；但是在鹽脅迫下的熒光定量PCR分析表明，MvNHX1在鹽脅迫后表達上調，而MvDREB1在鹽脅迫后仍為低水平表達，說明這兩個基因的啟動子響應鹽脅迫的元件有區(qū)別，這可能也與MvNHX1啟動子中CAAT框元件和MvDREB1啟動子中MYC元件有關，因為本研究是在室溫下進行的，可能由于溫度較高使得在高鹽的情況下MvNHX1啟動子較MvDREB1啟動子更容易啟動基因表達。由于光、溫度、水分等環(huán)境因素影響植物生長發(fā)育和農作物產量，各種因素對植物的影響不是孤立的，在一定程度上是相互聯系的，如低溫和高溫會造成植物生理脫水，所以，MvNHX1可能在高溫、干旱、高鹽時調控下游基因表達，MvDREB1啟動子可能在低溫、干旱時調控下游基因的表達。所以這兩種基因啟動子中各種作用元件之間的相互協(xié)同使得植物中同一基因啟動子可以對多種環(huán)境脅迫產生響應，誘導基因表達，提高植物對環(huán)境的適應能力[17-18]。

圖4 MvNHX1啟動子序列和結構Fig.4 The sequence and structure of MvNHX1 promoter

研究基因轉錄調控機制進而構建基因表達調控網絡的關鍵在于基因啟動子區(qū)轉錄調控元件的識別，生物信息學方法是解決該類問題的重要手段之一。本研究采用“保守區(qū)段中轉錄調控元件掃描”和“基因啟動子區(qū)保守區(qū)段的識別”相結合的方法進行調控元件發(fā)掘，相比使用在線相關軟件(PLACE、PlantCARE等)對單條基因啟動子區(qū)進行調控元件的識別，可能會缺失對部分轉錄調控元件的識別結果，但是在一定程度上卻能增加識別結果的準確性，從而為揭示基因的轉錄調控機制提供更可靠的支撐。但生物信息學分析也存在一定誤差。因此，要準確分析MvDREB1和MvNHX1基因啟動子的功能，需要進一步驗證，如可以通過構建克隆到的新啟動子植物表達載體取代細胞中原有的啟動子，轉入后，通過檢測細胞對各種脅迫的反應，才能確定此啟動子的類型以及受什么因素的誘導等。

本研究已克隆得到新牧1號苜蓿兩個抗逆基因MvNHX1和MvDREB1的啟動子序列，并通過熒光定量PCR和生物信息學方法分析了兩個基因啟動子的類型和結構等，但沒有對這兩個基因的轉錄調控元件進行分析，它們是通過什么機制來調控基因表達的還有待于進一步研究。本研究為進一步揭示MvNHX1和MvDREB1基因的表達調控機制以及后續(xù)的轉入受體植物中研究其是否能驅動抗逆基因進行表達從而提高作物抗逆性提供了必要的前期基礎。

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