全氟辛酸在小鼠肝脂質(zhì)過氧化損傷中的作用

郎 朗，宋維平，季宇彬

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心，哈爾濱150076)

全氟辛酸是制造不粘材料過程中的一種基本加工助劑，以其優(yōu)良的熱穩(wěn)定性、化學(xué)穩(wěn)定性、高表面活性及疏水疏油性能，被廣泛地應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)和生活消費(fèi)領(lǐng)域［1］.隨著環(huán)境科學(xué)界對(duì)全氟辛酸研究的日益深入，人們逐漸認(rèn)識(shí)到全氟辛酸以及這類化合物具有難降解性、生物蓄積性和沿食物鏈在生物體內(nèi)富集作用，其對(duì)生物體的危害作用也不容忽視［2］，本文從氧化損傷角度，對(duì)全氟辛酸誘導(dǎo)的肝臟毒性及其機(jī)制進(jìn)行研究.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

全氟辛酸(上海富諾林精細(xì)化工有限公司);谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)試劑盒;谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)試劑盒;堿性磷酸酶(ALP)試劑盒;超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒;還原型谷胱甘肽(GSH)試劑盒;丙二醛(MDA)試劑盒;考馬斯亮藍(lán)試劑盒(試劑盒均購(gòu)自南京建成).

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小白鼠:雌鼠、雄鼠各20只，體重(20± 2)g，合格證為黑動(dòng)字第POOl01006號(hào)，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心繁殖提供.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組

取全氟辛酸純品，制備成442.59 mg/kg即LD50的劑量，以植物油為溶劑.將小鼠分成四個(gè)劑量組灌胃，分別為空白組、1/16LD50、1/8LD50、1/ 4LD50.其中每組10只小鼠雌雄各半.

1.3.2 蘇木精－伊紅(HE)染色法觀察小鼠肝臟病理學(xué)變化

小鼠連續(xù)灌胃14 d后斷頸處死.取肝臟適量切成小塊，用PBS沖洗后備用.將肝組織切成1 cm ×1 cm×1 cm大小，放入改良Davidson固定液(140 mL95%乙醇，62.5 mL冰醋酸，375 mL甲醛0.37 g/mL，422.5 mL蒸餾水，室溫保存3個(gè)月)中室溫固定48 h以上;脫水;石蠟包埋;切片;染色觀察.

1.3.3 超氧化物歧化酶(SOD);還原型谷胱甘肽(GSH);丙二醛(MDA)測(cè)定

小鼠連續(xù)灌胃14 d后斷頸處死.取肝臟組織1 g，按重量體積比加生理鹽水制備成10%組織勻漿，2 000 r/min離心10 min，取上清備用.進(jìn)行SOD、GSH、MDA的測(cè)定，按試劑盒要求進(jìn)行操作.

1.3.4 谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)測(cè)定

小鼠連續(xù)灌胃14 d后眼球取血，3 000 r/min離心10 min，分離血清備用.進(jìn)行ALT、AST、ALP測(cè)定，按試劑盒要求進(jìn)行操作.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 蘇木精－伊紅(HE)染色法觀察小鼠肝臟病理變化

HE染色切片結(jié)果顯示在400倍鏡下觀察，空白組雌雄小鼠肝組織質(zhì)地均勻，肝管肝竇紋理清晰，肝細(xì)胞質(zhì)地均勻，細(xì)胞核完整.1/16LD50染毒組肝竇肝管明顯變窄，肝細(xì)胞不完整，細(xì)胞核溢出.1/8LD50、1/4LD50染毒組肝管肝竇基本消失，肝小葉中心區(qū)的肝細(xì)胞有萎縮、變性、甚至壞死消失等改變.細(xì)胞胞漿內(nèi)含有少量大小不等的脂肪滴，細(xì)胞核被擠至一邊，有圓形空泡，見圖1.

圖1 HE染色切片觀察全氟辛酸對(duì)小鼠肝臟的影響變化

2.2 SOD、GSH、MDA測(cè)定結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組相比，高、中、低劑量染毒組小鼠組織勻漿中SOD活性顯著降低，MDA含量顯著升高，GSH活性顯著降低.均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，如表1所示.

表1 全氟辛酸對(duì)小鼠肝組織勻漿中SOD、MDA和GSH的影響

2.3 ALT、AST、ALP測(cè)定結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，通過灌胃染毒PFOA兩周后，高、中、低劑量染毒組小鼠血清中ALT和AST活性明顯高于空白組，而且均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，如表2所示.低劑量組小鼠血清ALP活性與空白組相比顯著升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05).高、中劑量組與空白組相比ALP活性有升高趨勢(shì)，但是沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

表2 全氟辛酸對(duì)小鼠血清ALT、AST和ALP活性的影響

3 討論

SOD是體內(nèi)非常重要的抗氧化酶和氧自由基清除劑，SOD活力的高低間接反應(yīng)了機(jī)體清除氧自由基的能力，而MDA的高低又間接反應(yīng)了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度.GSH是肝細(xì)胞內(nèi)主要的水溶性抗脂質(zhì)過氧化物質(zhì)，除了調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)外，GSH還有明顯的解毒功能.上述三者能較好的反映體內(nèi)氧自由基水平及脂質(zhì)過氧化損傷程度［3－5］.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高、中、低染毒組小鼠肝勻漿SOD活性顯著低于空白組(P＜0.01)，MDA含量顯著高于空白組(P＜0.01)，GSH含量顯著低于空白組(P＜0.01).說明染毒組動(dòng)物的抗氧化能力顯著降低，致使自由基清除不足，發(fā)生過氧化損傷，脂質(zhì)過氧化物在體內(nèi)積蓄，所以MDA含量升高明顯.

反映肝損傷嚴(yán)重程度的常用酶類有谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和血清中堿性磷酸酶(ALP).ALT主要存在于肝細(xì)胞原漿的可溶部分，ALT活性升高提示肝細(xì)胞遭到破壞，細(xì)胞膜通透性增強(qiáng).AST主要存在于肝細(xì)胞線粒體中，AST活性提高提示線粒體損傷.所以ALT和AST是檢測(cè)肝臟疾病的敏感指標(biāo).在正常情況下，肝細(xì)胞膜能將細(xì)胞內(nèi)的酶保持在細(xì)胞內(nèi)，維持肝細(xì)胞與肝竇狀隙之間存在的一個(gè)明顯酶濃度梯度.當(dāng)外源性化合物和代謝過程中生成的自由基直接侵害肝細(xì)胞膜時(shí)，肝細(xì)胞膜有任何細(xì)微改變都影響其通透性，胞漿內(nèi)ALT及AST向肝血竇溢出，并進(jìn)入周圍血流，血清ALT及AST活性增加，以ALT上升為主;若肝臟損傷嚴(yán)重導(dǎo)致線粒體受損，AST才會(huì)大量釋出，使血清AST升高大于ALT.血清中AST活性越高，肝損傷則越嚴(yán)重［6－8］.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白組比較高、中、低染毒組小鼠血清中ALT和AST活性均明顯升高(P＜0.01)，說明PFOA能夠引起小鼠肝細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的損傷，同時(shí)導(dǎo)致小鼠肝細(xì)胞線粒體的損傷.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，低劑量組小鼠血清中堿性磷酸酶(ALP)活性與空白組比較顯著增多，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.5)，而高、中劑量組ALP活性與空白組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.可能是由于肝內(nèi)ALP主要位于膽管區(qū)，遠(yuǎn)離肝竇，即使肝損傷ALP成為可溶性，其進(jìn)入膽汁的量也遠(yuǎn)多于進(jìn)入血中的量［9－10］.

以上結(jié)果顯示，PFOA能夠使機(jī)體抗氧化能力顯著降低，致使自由基清除不足，發(fā)生過氧化損傷，脂質(zhì)過氧化物在體內(nèi)蓄積，破壞了細(xì)胞膜和線粒體膜的通透性導(dǎo)致小鼠肝損傷.

［1］ CALAFAT A M，NEEDHAM L L，KUKLENYIK Z，et al.Perfluorinated chemicals in selected residents of the American continent［J］.Chemospherem.，2006，63(4):490－496.

［2］ 胡存麗，仲來福.全氟辛烷磺酸和全氟辛酸毒理學(xué)研究進(jìn)展［J］.中國(guó)工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志.2006，6(12):354－358.

［3］ FAMTONE J C，WARD P A.Pole of Oxygen derived free frdicals and metabolites in leukocyte dependent inflammatory reactions［J］.Am J pathol.，1982，107(3):395－418.

［4］ CROSS C E.Oxygen radicals and human disease［J］.Am Inter Med.，1987，107(4):526.

［5］ IMITH M T，THOR H，HARTZEU P，et al.The treatments of lipid peroxidationin isolated hepatocytes［J］.Biochem pharmacol.1982，8:18－26.

［6］ 王寶恩，張定鳳.現(xiàn)代肝臟病學(xué)［M］.北京:科學(xué)出版社，2003:182.

［7］ BOHME M，MULLER M，LEIER I，et al.Cholestasis caused by inhibition of the adenosine triphosphate－dependent bile salt transport in rat liver［J］.Gastroenterology，1994，107:255－265.

［8］ LU S C，TSUKAMOTO H.Role of abnormal methionine metabolism in alcoholic liver injury［J］.Alcohol.，2002，27(3): 15562.

［9］ LIEBER C S.Alcoholic fatty liver:its pathogenesis and mechanism of progression to inflammation and fibrosis［J］.Alcohol.，2004，34(1):9－19.

［10］ 張 昭，郎 朗，季宇彬.HPLC對(duì)雌性小鼠血清全氟辛酸質(zhì)量濃度分析［J］.哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2011，27(6):794－795，827.