復(fù)方苦豆子對腎性高血壓復(fù)合高脂血癥大鼠血漿內(nèi)皮素和一氧化氮合成酶的影響

劉曉敏，陳 虹

(1吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院，吉林吉林132013;2石河子大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)系省部共建新疆特種植物藥資源教育部重點實驗室)

復(fù)方苦豆子(CK)由苦豆子、決明子、山楂等八味中藥組成。本課題組研究發(fā)現(xiàn)其可改善血脂代謝紊亂狀態(tài)并有降低血壓的作用［1～3］。但這些均針對單獨疾病模型進(jìn)行研究，CK對高血壓合并高脂血癥復(fù)合模型是否能同時具有降壓調(diào)脂作用，其作用機(jī)制如何?2006年1月～2007年12月，我們對這個方向進(jìn)行了研究，為課題的進(jìn)一步開展提供更寬的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取健康清潔級Wistar大鼠，雄性，2～3月齡，體質(zhì)量170～190 g，購自新疆維吾爾自治區(qū)實驗動物研究中心(合格證號:醫(yī)動字第2號)。

1.2 主要儀器 RBP-1B型清醒大鼠血壓心率測定儀(北京中日友好醫(yī)院);DL-5低速大容量離心機(jī)、GL-16M臺式高速冷凍離心機(jī)(湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司);酶標(biāo)儀(Thermo electron corporation); XH-6010Y放射免疫計數(shù)器(陜西二六二醫(yī)療儀器廠);PCUV-2501紫外分光光度計(日本島津)。

1.3 主要試劑與試劑盒 復(fù)方苦豆子流浸膏(石河子大學(xué)省部共建新疆特種植物藥資源教育部重點實驗室自制，1 mL含生藥2.50 g);膽固醇(美國進(jìn)口);膽酸鈉(上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司);丙基硫氧嘧啶(上海復(fù)星朝暉藥業(yè)有限公司);卡托普利片(上海安源安徽仁濟(jì)制藥有限公司);血脂康膠囊(北京北大維信生物科技有限公司);TC、TG、HDL-C試劑盒(溫州津瑪生物科技有限公司);LDL-C試劑盒(浙江東甌生物工程有限公司);ET放射免疫分析測定盒(北京北方生物技術(shù)研究所);NOS測試盒(南京建成生物工程研究所);其他試劑均為分析純。

1.4 模型建立及分組 按文獻(xiàn)建立腎性高血壓復(fù)合高脂血癥大鼠模型［4］。復(fù)合模型建成后，選取造模成功的大鼠開始分組給藥，每組12只，CK高、中、低劑量組［11.13 g/(kg·d)、5.56 g/(kg·d)、2.78 g/(kg·d)］;陽性對照組:卡托普利［0.01 g/(kg· d)］+血脂康［0.8 g/(kg·d)］;模型組:蒸餾水;假手術(shù)組(n=10):蒸餾水+基礎(chǔ)飼料。每天灌服1次，上午10點灌藥，晚上8點灌脂肪乳5 mL/(kg·學(xué)處理，實驗數(shù)據(jù)以s表示。組間分析采用One-Way ANOVA兩兩比較得到相應(yīng)的P值。以P≤0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腎性高血壓復(fù)合高脂血癥模型的建立共80只大鼠，其中70只接受兩腎一夾(2K1C)法造模手術(shù)，10只為假手術(shù)組。術(shù)后4周末所有實驗大鼠測量血壓，取血檢測血漿TC、TG、HDL-C、LDL-C，與假手術(shù)組比較共有10只大鼠造模失敗被剔除，建立成功復(fù)合模型共60只，造模成功率86%。造模組與假手術(shù)組比較，血壓、TC、LDL-C明顯升高，具有極顯著性(P＜0.01)，HDL-C降低顯著(P＜0.05)。說明腎性高血壓復(fù)合高脂血癥模型構(gòu)建成功。結(jié)果見表1。 d)，每周稱量大鼠體質(zhì)量，連續(xù)灌胃8周。各組灌胃容積相同，不足之處灌胃蒸餾水達(dá)到一致。

1.5 觀察指標(biāo)及方法 體質(zhì)量:每周同一時間稱重1次，記錄各組大鼠體質(zhì)量的變化情況。尾動脈收縮壓、心率:在給藥8周，用RBP-1B型清醒大鼠血壓心率測定儀測量血壓、心率。肝臟脂質(zhì)(TC、TG):給藥8周末大鼠取血處死后，分離肝臟無菌生理鹽水洗凈，濾紙吸干，從中摘取動物肝臟0.5 g，放入玻璃勻漿器中，加入4.5 mL甲醇—氯仿混合液(1∶1)，研磨制成10%的肝勻漿，于14 520 g離心30 min，取上清液待測［5］。內(nèi)皮素(ET):取血后，將血液迅速注入到含酶抑制劑的抗凝管中，低溫離心(4℃，14 520 g，10 min)，分離血漿，－70℃保存待測?？傄谎趸厦?T-NOS)、結(jié)構(gòu)型一氧化氮合酶(cNOS):取血后，將血液置于肝素凝處理過的離心管中，14 520 g離心10 min后取上層血漿，－70℃保存待測。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計

表1 大鼠實驗4周末觀察指標(biāo)變化(s)

表1 大鼠實驗4周末觀察指標(biāo)變化(s)

注:與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，△P＜0.01

組別 血壓(mmHg) TC(mmol/L) TG(mmol/L) HDL-C(mmol/L) LDL-C(mmol/L)假手術(shù)組 119.74±6.87 0.89±0.07 0.85±0.08 0.60±0.05 0.35±0.03造模組 159.37±18.79△ 5.06±0.47△ 2.37±0.19△ 0.31±0.04* 3.45±0.31△

2.2 CK對腎性高血壓復(fù)合高脂血癥大鼠體質(zhì)量的影響 實驗中大部分大鼠健康狀況良好，模型組動物精神較差，飲食飲水少，皮毛粗糙少光澤，部分大鼠出現(xiàn)腹瀉。各給藥組大鼠之間飲食、二便無明顯差別。各組體質(zhì)量變化比較見表2。

2.3 CK對腎性高血壓復(fù)合高脂血癥大鼠血壓、心率的影響 隨著用藥時間的延長，假手術(shù)組血壓趨于平穩(wěn)，處于正常范圍內(nèi)，模型組血壓不斷上升，到8周時血壓達(dá)到180 mmHg。各組血壓、心率變化比較見表3。

2.4 CK對腎性高血壓復(fù)合高脂血癥大鼠肝臟脂質(zhì)(TC、TG)含量的影響 給藥8周后，中劑量組、高劑量組與模型組比較肝臟TC、TG含量明顯下降(P＜0.01);低劑量組降低幅度較小(P＜0.05)。結(jié)果見表4。

2.5 復(fù)方苦豆子制劑對腎性高血壓復(fù)合高脂血癥大鼠血漿ET、NOS的影響

表2 實驗期間各組大鼠的體質(zhì)量變化比較(g，s)

表2 實驗期間各組大鼠的體質(zhì)量變化比較(g，s)

注:與模型組比較，*P＜0.05，△P＜0.01;與假手術(shù)組比較，#P＜0.05，▲P＜0.01

組別 n 給藥前 給藥1周 給藥2周 給藥4周 給藥8周假手術(shù)組 10 242.7±18.2 255.6±16.3 267.3±21.5 287.8±26.2 340.1±18.5模型組 12 246.4±14.7 266.7±23.5 260.3±19.2 250.2±17.7# 245.8±29.3▲高劑量組 12 247.4±12.5 257.7±13.2 250.4±12.1 268.1±17.6*# 317.9±26.3△#中劑量組 12 248.2±18.3 260.3±19.5 255.1±17.0 272.8±21.6*# 325.3±27.1△#低劑量組 12 249.6±17.4 256.8±17.7 250.7±15.2 256.5±25.6# 285.0±26.1△▲陽性對照組 12 250.8±13.9 255.3±18.5 249.9±17.7 278.6±27.8 315.6±28.3△#

表3 用藥8周后CK對復(fù)合模型大鼠收縮壓及心率的影響(s)

表3 用藥8周后CK對復(fù)合模型大鼠收縮壓及心率的影響(s)

注:與模型組比較，*P＜0.01;與假手術(shù)組比較，△P＜0.05，#P＜0.01

組別 n 治療前收縮壓(mmHg) 心率(次/min)治療后收縮壓(mmHg) 心率(次/min)假手術(shù)組 10 119.7±6.9 342.7±25.2 116.1±8.3 341.6±36.4模型組 12 159.2±7.5# 361.8±33.8△ 180.5±5.1# 379.3±37.6△高劑量組 12 159.7±13.5 369.7±34.8 135.6±8.6* 373.5±34.4中劑量組 12 157.9±10.8 372.6±36.7 133.3±12.2* 378.6±37.3低劑量組 12 159.1±11.9 387.3±34.5 169.3±10.0 382.6±35.5陽性對照組 12 159.4±11.2 369.6±36.7 131.2±10.5*368.4±36.2

表4 用藥8周復(fù)方苦豆子制劑對復(fù)合模型大鼠肝臟TC、TG(mmol/L)含量的影響(s)

表4 用藥8周復(fù)方苦豆子制劑對復(fù)合模型大鼠肝臟TC、TG(mmol/L)含量的影響(s)

組別 n TC TG假手術(shù)組10 0.58±0.07 0.52±0.08模型組 12 3.37±0.41## 4.05±0.57##高劑量組 12 2.25±0.29＊＊ 2.38±0.30*中劑量組 12 1.82±0.25＊＊ 2.13±0.32＊＊低劑量組 12 2.95±0.37 3.49±0.28*陽性對照組 12 1.88±0.23＊＊ 2.75±0.34＊＊

2.5.1 用藥8周復(fù)方苦豆子制劑對復(fù)合模型大鼠血漿ET水平的影響 中劑量組與模型組比較明顯降低血漿ET水平(P＜0.05)，高劑量組和低劑量組降低幅度較小(P＞0.05)。結(jié)果見表5。

2.5.2 用藥8周復(fù)方苦豆子制劑對復(fù)合模型大鼠血漿NOS含量的影響 中劑量組、高劑量組與模型組比較，明顯升高血漿T-NOS、cNOS含量(P＜0.01)。結(jié)果見表5。

表5 用藥8周復(fù)方苦豆子制劑對復(fù)合模型大鼠血漿ET、NOS水平的影響(s)

表5 用藥8周復(fù)方苦豆子制劑對復(fù)合模型大鼠血漿ET、NOS水平的影響(s)

注:與模型組比較，*P＜0.05，△P＜0.01;與假手術(shù)組比較，#P＜0.01

組別 n TC(mmol/L) TG(mmol/L) ET(pg/mL) T-NOS(U/mL) cNOS(U/mL)假手術(shù)組 10 0.58±0.07 0.52±0.08 173.74±12.64 37.78±2.26 21.93±1.81模型組 12 3.37±0.41# 4.05±0.57# 272.20±25.43# 26.50±1.87# 9.33±0.85#高劑量組 12 2.25±0.29△ 2.38±0.30* 219.47±19.18 33.18±1.28△ 15.69±1.32△中劑量組 12 1.82±0.25△ 2.13±0.32△ 205.32±18.54* 35.35±2.98△ 19.75±1.65△低劑量組 12 2.95±0.37 3.49±0.28* 238.43±21.85 27.32±1.96 10.01±1.13陽性對照組 12 1.88±0.23△ 2.75±0.34△ 181.35±14.40△ 37.64±2.14△ 19.14±1.96△

3 討論

從本部分實驗結(jié)果可以看出，CK可降低高血壓復(fù)合高脂血癥模型大鼠的血壓，調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì);在高血壓并發(fā)高脂血癥癥狀態(tài)下，大鼠的內(nèi)皮損傷更加嚴(yán)重，用藥8周后，隨著血壓血脂的下降，各給藥組血漿ET水平不同程度的降低，T-NOS和cTOS都不同程度的升高，說明復(fù)方苦豆子制劑的降壓調(diào)脂作用與ET分泌、NO的合成減少有關(guān)系。以高、中劑量組效果明顯，與陽性對照藥物在改善內(nèi)皮功能方面具有相似之處［6，7］。ET和NOS與高血壓和高脂血癥的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，因此，推測CK降壓調(diào)脂作用與內(nèi)皮系統(tǒng)的調(diào)節(jié)有關(guān)。

高血壓、高脂血癥的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，以往僅從腎素血管緊張素系統(tǒng)對CK的降壓機(jī)制進(jìn)行了研究［2］，而其降壓調(diào)脂作用與內(nèi)皮系統(tǒng)的關(guān)系從未研究。本部分實驗探討了CK降壓調(diào)脂作用與ET和NOS的關(guān)系，反過來也進(jìn)一步證明了CK的作用。在實驗中可看到中劑量組效果最好，好于高劑量組，并沒有像許多西藥一樣呈現(xiàn)較為明顯的量效關(guān)系。出現(xiàn)這種現(xiàn)象是否由于該制劑仍然是含有多種性質(zhì)相近的成分的混合物，因而各成分之間的藥效可能有不小的差異?在低劑量可能某些成分還沒有達(dá)到其閾濃度，而在較高劑量其藥理活性則充分顯示出來，當(dāng)達(dá)到一定濃度時有些成分又出現(xiàn)了副作用而影響了其他成分的作用?在高劑量與中劑量之間是否還有一個最佳劑量還有待進(jìn)一步研究。陽性對照組采用了降壓藥物卡托普利和調(diào)血脂藥物血脂康聯(lián)合灌胃治療，與臨床高血壓復(fù)合高脂血癥的患者的治療方案相似，從而使研究更加符合臨床實際。

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