磁性溫敏復(fù)合微球的制備及磁場中的釋藥行為

姚愛華，陳 綺，艾凡榮，3，王德平

（1.同濟(jì)大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，上海201804；2.同濟(jì)大學(xué)先進(jìn)土木工程材料教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海201804；3.南昌大學(xué)機(jī)電工程學(xué)院，江西南昌330031）

腫瘤的磁熱療法是利用腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞對熱的敏感性不同，通過將磁性納米粒子注射或植入腫瘤組織，然后在外加磁場的作用下產(chǎn)生熱量，再將產(chǎn)生的熱量傳遞給腫瘤組織，由于腫瘤中的血液供給不如正常組織充足，致使腫瘤細(xì)胞中熱量擴(kuò)散較慢，結(jié)果造成局部溫度升高（一般控制在42～47°C之間），從而達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞的目的［1－3］.由于磁性納米粒子具有升溫效應(yīng)明顯、給排方法簡單、產(chǎn)熱均勻等特點(diǎn)，在腫瘤熱療的研究中顯示出越來越明顯的優(yōu)勢.Fe3O4納米粒子因具有較好磁熱性能和良好的生物相容性，已被廣泛用作腫瘤磁熱療的種籽材料［4－5］.

將磁性納米粒子與溫度敏感性的聚合物復(fù)合而制備的兼有磁響應(yīng)性和溫度響應(yīng)性的復(fù)合微球，即磁性溫敏復(fù)合微球，可有效結(jié)合熱療的優(yōu)勢和靶向給藥的特點(diǎn)，使腫瘤熱療與化療相互促進(jìn)，增強(qiáng)腫瘤的治療效果，在腫瘤治療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景［6－8］.磁性納米粒子賦予微球磁性，一方面可以在外加磁場的作用下定向運(yùn)載藥物到病變部位，同時(shí)磁性納米粒子在交變磁場作用下使組織細(xì)胞升溫至腫瘤熱療溫度，在體內(nèi)同步進(jìn)行腫瘤的磁熱療.溫敏性聚合物賦予微球溫度響應(yīng)性能，利用其在常溫下的溶脹特性來裝載藥物，而在其最低臨界溶解溫度（LCST）上下實(shí)現(xiàn)收縮－溶脹的可逆轉(zhuǎn)變，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)藥物的可控釋放.聚合物收縮－溶脹轉(zhuǎn)變的熱量由磁性納米粒子提供，從而無需使用特殊的加溫設(shè)備.為了實(shí)現(xiàn)上述目的，需要控制溫敏性聚合物的LCST在腫瘤熱療的溫度范圍內(nèi)（42～47°C）.

聚（N－異丙基丙烯酰胺）（PNIPAAm）水凝膠及其共聚物是目前研究最多的溫敏性聚合物，研究顯示，純N－異丙基丙烯酰胺（NIPAAm）水凝膠的LCST約為32°C，通過與親水性更強(qiáng)的有機(jī)單體共聚可增加整個(gè)聚合物的親水性，并增大聚合物與水分子之間的作用，從而提高其LCST［9］.本文將NIPAAm與丙烯酰胺（Am）共聚，獲得了LCST為42°C的溫敏性聚合物，并采用無皂乳液聚合方法使其包覆在Fe3O4納米粒子的表面，制備了Fe3O4／P（NIPAAm－co－Am）磁性溫敏復(fù)合微球，研究了微球的結(jié)構(gòu)、形貌及其在磁場作用下的磁熱性能，并以維生素B12為模型藥物，研究了復(fù)合微球在磁場作用下的藥物釋放過程.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料和測試

油酸，化學(xué)純；FeCl3·6H2O，Na2SO3，濃氨水，過硫酸銨（APS），N，N－亞甲基雙丙烯酰胺（MBA），均為分析純，以上試劑均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，使用前未進(jìn)行進(jìn)一步的純化處理；N－異丙基丙烯酰胺（NIPAAm），分析純，購于百靈威化學(xué)試劑有限公司，使用前采用正己烷重結(jié)晶純化；丙烯酰胺（Am），分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，使用前采用氯仿重結(jié)晶純化.傅里葉變換紅外光譜（FT－IR，Bruker EQUINOXSS），采用KBr粉末壓片法進(jìn)行測試；透射電鏡（TEM，Hitachi H－800）；振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)（VSM，南京大學(xué)儀器廠LH－3），GW系列中頻交變電流磁場發(fā)生器（南京大學(xué)儀器廠），頻率范圍為55～70kHz，最大磁場強(qiáng)度為7×103A·m－1；紫外－可見光分光光度計(jì)（JASCO V－570）.

1.2 Fe3O4／P（NIPAAm co Am）磁性溫敏復(fù)合微球的制備

首先采用部分還原共沉淀法制備的Fe3O4納米粒子，并用油酸對其表面進(jìn)行修飾，所得樣品記為OA－Fe3O4，具體制備方法如文獻(xiàn)［10］所述.量取2mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的Fe3O4磁流體，分散于50 mL去離子水中，用濃氨水調(diào)節(jié)pH值至10，倒入三口燒瓶中，然后分別加入0.1g NIPAAm，0.003g Am，0.01g MBA.往溶液中充氮?dú)夤呐?0min，以除去反應(yīng)體系中的氧氣，然后升溫至70°C，加入0.1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的APS濃液，反應(yīng)7h后，磁分離產(chǎn)物，再分別用去離子水和無水乙醇洗滌3次，冷凍干燥，即得Fe3O4／P（NIPAAm－co－Am）復(fù)合微球.

1.3 P（NIPAAm co Am）共聚物L(fēng)CST值的測定

采用紫外－可見光分光光度計(jì)在500nm處測定不同溫度下樣品的透過率，升溫速率為1℃·min－1，每個(gè)溫度點(diǎn)停留2min讀數(shù)，并繪制樣品透過率隨溫度的變化曲線，曲線上透過率變化最大的點(diǎn)可確定為樣品的LCST值.

1.4 維生素B12在復(fù)合微球中的裝載及磁場作用下的釋放過程

以維生素B12為藥物模型.稱取0.1g質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的Fe3O4（OA－Fe3O4納米粒子加入質(zhì)量占有機(jī)單體質(zhì)量的10%）復(fù)合微球樣品，置于5mL離心管中，并在離心管中加入4mL質(zhì)量濃度為1 mg·mL－1的維生素B12磷酸鹽緩沖溶液（PBS）濃液，進(jìn)行藥物裝載.藥物釋放過程測定：將上述載有維生素B12的載藥微球浸泡于4mL PBS液中，并置于60kHz，6.5kA·m－1的交變磁場中，連續(xù)或間歇施加交變磁場.在“連續(xù)”實(shí)驗(yàn)中，持續(xù)施加磁場12 h，在此期間，每隔1h移取1mL PBS液，并補(bǔ)充相同體積的PBS液至4mL；而在“間歇”實(shí)驗(yàn)中，每3h施加交變磁場1h，待1h的磁場作用結(jié)束，移取1 mL PBS液，并補(bǔ)充相同體積的PBS液至4mL.用紫外－可見光分光光度計(jì)檢測取出液在360nm處的吸光度，并計(jì)算維生素B12的濃度；根據(jù)溶液中維生素B12的濃度，計(jì)算不同時(shí)間的藥物釋放率，繪制釋放曲線.

2 結(jié)果與討論

2.1 磁性溫敏Fe3O4／P（NIPAAm co Am）聚合物微球的結(jié)構(gòu)和形貌

圖1為OA－Fe3O4和Fe3O4／P（NIPAAm－co－ Am）的紅外圖譜，圖中586cm－1處較強(qiáng)的吸收峰為Fe3O4中Fe—O鍵的特征振動(dòng)峰；2 969，2 927，2 851cm－1處的吸收帶對應(yīng)于—CH3和—CH2的對稱和不對稱伸縮振動(dòng).OA－Fe3O4的紅外圖譜中，1 710cm－1處的吸收峰歸因于物理吸附在Fe3O4表面的油酸分子中C== O鍵的伸縮振動(dòng)，而化學(xué)吸附在Fe3O4表面的油酸分子中的COO－因與Fe3＋發(fā)生偶合作用，使其伸縮振動(dòng)峰偏移至1 640cm－1附近［11］.Fe3O4／P（NIPAAm－co－Am）的紅外圖譜中，—C（CH3）2的彎曲振動(dòng)在1 365cm－1和1 386cm－1處分裂為雙峰，1 642cm－1和1 548cm－1分別為酰胺Ⅰ和酰胺Ⅱ的特征吸收峰，由于—OH和N—H鍵的吸收峰重疊，在3 420cm－1處出現(xiàn)了寬泛的吸收峰.上述結(jié)果表明，P（NIPAAm－co－Am）共聚物已經(jīng)成功包覆在Fe3O4的表面.

圖1 油酸改性Fe3O4納米粒子和聚合物微球的紅外圖譜Fig.1 FTIR spectra of OA－Fe3O4and the composite microspheres

2.2 P（NIPAAm co Am）共聚物的LCST值

聚（N－異丙基丙烯酰胺）（PNIPAAm）是一種常用的溫敏性聚合物，因PNIPAAm大分子側(cè)鏈上同時(shí)具有親水性的酰胺基—CONH—和疏水性的異丙基—CH（CH3）2而顯示出溫度敏感特性［12］.聚合物存在LCST，當(dāng)外界溫度低于LCST時(shí)，其分子鏈上的親水基團(tuán)與進(jìn)入其內(nèi)部的水分子形成氫鍵，使鏈段溶于水而發(fā)生溶脹，因此聚合物能夠穩(wěn)定而均勻地溶解于水.當(dāng)溫度升高達(dá)到聚合物的LCST時(shí)，氫鍵被破壞，鏈段的疏水性增強(qiáng)，單個(gè)微凝膠發(fā)生收縮，水分子被排出，同時(shí)這種疏水作用又導(dǎo)致分子鏈之間發(fā)生相互聚集，形成較大的聚集體.因而當(dāng)溫度升至LCST時(shí)，溫敏聚合物溶液對光的折射、散射等作用會發(fā)生突變.因此，可通過測定不同溫度下樣品的透過率來確定其LCST值［13］，利用此方法測定P（NIPAAm－co－Am）聚合物的LCST值，結(jié)果如圖3所示.由圖可知，所得共聚物的LCST值約為42°C，此溫度恰好落在腫瘤熱療的溫度范圍內(nèi)，因此將該共聚物與Fe3O4納米粒子復(fù)合，有望同步實(shí)現(xiàn)腫瘤熱療和化療藥物的可控釋放，增強(qiáng)治療的效果.

圖2 油酸改性前后Fe3O4納米粒子和磁性溫敏復(fù)合微球的TEM圖Fig.2 Transmission electron microscopy images of bare and OA－Fe3O4nanoparticles and the composite microspheres

2.3 Fe3O4／P（NIPAAm co Am）復(fù)合微球磁熱性能

為了研究磁性溫敏Fe3O4／P（NIPAAm－co－Am）復(fù)合微球在磁場作用下的熱性能，將20mg充分溶脹的復(fù)合微球加入1mL去離子水中制成懸浮液，置于65kHz，6.5kA·m－1的交變磁場中，記錄水溫隨時(shí)間的變化，結(jié)果如圖4所示.圖中顯示水溫在初始時(shí)間段內(nèi)升高較快，20min內(nèi)即升溫至42°C左右，接近聚合物微球的LCST，此后由于材料產(chǎn)熱和散熱逐漸趨于平衡，使得溫度變化趨于平緩.60min內(nèi)升至47°C并維持不變.可見，復(fù)合微球內(nèi)的磁性納米粒子產(chǎn)生的熱量能夠滿足腫瘤熱療的要求，且足以使溫敏性聚合物P（NIPAAm－co－Am）因相變而收縮，從而實(shí)現(xiàn)藥物釋放.

2.4 磁性溫敏聚合物微球的藥物緩釋研究

為了研究復(fù)合微球在磁場作用下的藥物釋放行為，將載有維生素B12的微球置于65kHz，6.5 kA·m－1的交變磁場中，分別研究了磁場持續(xù)作用和間歇作用的影響.圖5為交變磁場持續(xù)作用下每小時(shí)的藥物釋放量及維生素B12的累積釋放曲線.從圖中可以看出，在藥物釋放初期存在突釋現(xiàn)象，1h內(nèi)藥物的釋放率達(dá)到49.4%，隨后釋放量逐漸減小，6h內(nèi)藥物的釋放基本達(dá)到平衡，12h內(nèi)的累積釋放率約為69.0%.

圖5 交變磁場持續(xù)作用下藥物緩釋曲線Fig.5 VB12release behavior of composite microspheres exposed continuously to a magnetic field

圖6 交變磁場間歇性作用下藥物釋放曲線Fig.6 VB12release behavior of composite microspheres exposed to an intermittent magnetic field

圖6a，b分別為間歇磁場作用下每小時(shí)的藥物釋放量及累積釋放曲線.結(jié)果顯示，當(dāng)不施加磁場時(shí)，藥物呈緩慢釋放狀態(tài)，施加磁場1h后藥物的釋放量急劇增加，但磁場進(jìn)入間歇期，藥物釋放速率再度趨于平緩.隨著磁場“開－閉”循環(huán)次數(shù)的增加，每次磁場作用下藥物的釋放量依次減小，由圖6a可知，三次施加磁場時(shí)藥物的釋放量分別為45%，19%和9%，三次循環(huán)后藥物的累積釋放率達(dá)到90%以上（見圖6b），遠(yuǎn)高于磁場持續(xù)作用下藥物的累積釋放率.

在交變磁場的作用下，復(fù)合微球內(nèi)部的Fe3O4納米粒子產(chǎn)生熱量，并將熱量傳遞給外層的溫敏性聚合物，當(dāng)溫度達(dá)到聚合物的LCST時(shí)，聚合物由親水態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷畱B(tài)，其分子內(nèi)和分子間的疏水作用增強(qiáng)，酰胺基團(tuán)與水分子之間的氫鍵被破壞，水分子從網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中排出，引起復(fù)合微球的體積收縮，從而使包封于聚合物中的藥物因“擠壓”效應(yīng)被釋放出來.相反，當(dāng)磁場停止作用時(shí)，由于環(huán)境散熱，溫度回落，當(dāng)?shù)陀诰酆衔锏腖CST時(shí)，聚合物恢復(fù)親水狀態(tài)，重新吸收水分而使自身溶脹，如此反復(fù)，即可實(shí)現(xiàn)圖6b所示的脈沖式藥物釋放.而對于連續(xù)磁場作用的情況，復(fù)合微球無法實(shí)現(xiàn)溶脹－收縮的循環(huán)，藥物的釋放僅通過自由擴(kuò)散作用，因此累積釋放率較低.由此，將載有化療藥物的磁性溫敏復(fù)合微球應(yīng)用于腫瘤治療，每次給藥后可以間歇施加磁場，相對于化療一次性給藥，不僅可大大降低化療藥物的毒副作用，還可顯著提高藥物的累積釋放率，提高療效.

3 結(jié)論

（1）將NIPAAm與Am共聚，獲得了LCST為42°C的溫敏性聚合物，并通過無皂乳液聚合方法使其包覆在Fe3O4納米粒子的表面，成功制備了具有核殼結(jié)構(gòu)的Fe3O4／P（NIPAAm－co－Am）磁性溫敏復(fù)合微球.

（2）所制備的復(fù)合微球顯示出良好的磁熱性能.在65kHz，6.5kA·m－1交變磁場作用下，20min內(nèi)即使自身升高至42°C，60min內(nèi)升至47°C并維持不變.微球所產(chǎn)生的熱量能夠滿足腫瘤熱療的要求，且足以使外層的溫敏性聚合物發(fā)生體積相變而實(shí)現(xiàn)藥物釋放.

（3）將載有維生素B12的微球置于交變磁場中，連續(xù)或間歇施加磁場，藥物的釋放行為明顯不同.與連續(xù)施加磁場相比，間歇式施加磁場可延長藥物的釋放周期，提高藥物的累積釋放率.

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