反復(fù)自然流產(chǎn)患者妊娠組織中Survivin、VEGF及Stat3的表達(dá)及相關(guān)性

張素芝 杜麗榮 韓宏偉 李國(guó)正 韓省華 劉效群 趙邦榮 張亦心

反復(fù)自然流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion，RSA)是指連續(xù)發(fā)生2次或2次以上的自然流產(chǎn)。其病因復(fù)雜，在發(fā)病患者中有60%～70%是不明原因的。滋養(yǎng)細(xì)胞的分化、浸潤(rùn)行為十分復(fù)雜，但調(diào)節(jié)極為精細(xì)，時(shí)間僅限于早孕期，滋養(yǎng)細(xì)胞具有與腫瘤細(xì)胞相似的浸潤(rùn)性生長(zhǎng)的生物學(xué)特性，早孕期滋養(yǎng)細(xì)胞迅速增生并侵蝕子宮內(nèi)膜。生存素(Survivin)是一類結(jié)構(gòu)獨(dú)特的哺乳類動(dòng)物凋亡抑制蛋白，具有抑制細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂的雙重功能，可表達(dá)于大多數(shù)腫瘤組織及多種轉(zhuǎn)化細(xì)胞。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，Survivin基因的上游啟動(dòng)片段中存在信號(hào)傳導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄活化子3(STAT3)的反應(yīng)元件，STAT3可能從上位調(diào)節(jié)Survivin的表達(dá)［1］;而血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)亦可以通過(guò)激活A(yù)kt/PKB信號(hào)途徑，提高Survivin基因在細(xì)胞中的表達(dá)。本研究從滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤(rùn)能力的調(diào)控角度，探討RSA患者孕早期妊娠組織中Survivin、VEGF及Stat3的表達(dá)及可能調(diào)控途徑。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2007年1至6月石家莊市婦幼保健院婦科門診就診的20～35歲RSA患者40例(RSA組)。病例選擇條件:發(fā)生過(guò)2次或2次以上自然流產(chǎn);孕周12周;流產(chǎn)前B超證實(shí)胚胎停育;夫婦外周染色體核型正常，無(wú)家族遺傳病史;血三碘甲狀腺原氨酸(T3)、甲狀腺素(T4)和促甲狀腺激素(TSH)檢查無(wú)甲狀腺功能異常、黃體功能不全、多囊卵巢綜合癥、高泌乳素血癥等內(nèi)分泌疾病;排除子宮畸形、Rh血型不合及TORCH(弓形蟲抗體、風(fēng)疹病毒抗體、巨細(xì)胞病毒抗體、柯薩奇病毒抗體和生殖器皰疹病毒抗體)檢測(cè)異常。同期隨機(jī)選擇無(wú)不良孕產(chǎn)史，有正常足月分娩史或無(wú)生育史的正常同年齡段、孕周相同要求人工流產(chǎn)的正常早孕女性20例做對(duì)照(對(duì)照組)。

1.2 研究方法

1.2.1 主要試劑與儀器:兔抗人VEGF單克隆抗體、兔抗人Survivin多克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，TNF-α酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒(北京博奧森生物公司)，聯(lián)苯二胺(DAB)底物顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。流式細(xì)胞儀Epics-XLⅡ型(Beckman Coulter，美國(guó))，全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀Bio-Rad 255型(Bio-Rad，美國(guó))。

1.2.2 組織免疫化學(xué)(SP法):10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片厚4 μm，經(jīng)逐級(jí)酒精水化至蒸餾水，微波抗原修復(fù)，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗，3%過(guò)氧化氫孵育5 min阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化酶，加正常羊血清封閉后，滴加一抗，37℃孵育1 h，PBS洗滌3次，每次3 min，加生物素標(biāo)記的抗兔IgG，37℃10 min，PBS洗滌3次，每次3 min，加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素，37℃10 min，PBS洗滌3次，每次3 min，DAB顯色，蘇木素淡復(fù)染，封片。陽(yáng)性對(duì)照Survivin為人胃癌組織，VEGF為人結(jié)腸癌組織，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。在光鏡下觀測(cè)結(jié)果。

1.2.3 結(jié)果判定:細(xì)胞中出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞顯色強(qiáng)度分級(jí)為陰性(0分)、黃色為弱陽(yáng)性(1分)、棕黃色為陽(yáng)性(2分)、深棕黃色為強(qiáng)陽(yáng)性(3分)。然后，應(yīng)用Image-Pro Plus多功能真彩色細(xì)胞圖象分析管理系統(tǒng)(Media Cybernetics，美國(guó))進(jìn)行圖象分析，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，觀察高倍視野中的所有細(xì)胞，記錄陽(yáng)性染色細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，0%～1%記0分，2%～10%記1分、11%～50%記2分、51%～80%記3分、81%～100%記4分。將細(xì)胞顯色強(qiáng)度和陽(yáng)性染色細(xì)胞百分?jǐn)?shù)計(jì)分相乘得免疫組織化學(xué)積分(IHS)值［2］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)數(shù)資料采用秩和檢驗(yàn)，兩因素間的相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

VEGF僅在絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞和蛻膜細(xì)胞的胞質(zhì)中有表達(dá);Survivin、Stat3在絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞和蛻膜細(xì)胞的胞質(zhì)及胞核中均有表達(dá)。RSA患者絨毛組織中Survivin、VEGF的表達(dá)水平高于對(duì)照組(P＜0.05)，二者在絨毛中的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.268，P＜0.05);RSA組與對(duì)照組的絨毛中Stat3的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，絨毛中Survivin與Stat3的表達(dá)不存在相關(guān)關(guān)系(r=-0.006，P＞0.05);RSA組與對(duì)照組蛻膜中Survivin、VEGF和 Stat3的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1～6。

表1 2組Survivin絨毛中的表達(dá) 例

表2 VEGF在RSA組與對(duì)照組的絨毛中的表達(dá) 例

表3 Stat3在RSA組與對(duì)照組的絨毛中的表達(dá) 例

表4 Survivin在RSA組與對(duì)照組的蛻膜中的表達(dá) 例

表5 VEGF在RSA組與對(duì)照組的蛻膜中的表達(dá) 例

表6 Stat3在RSA組與對(duì)照組的蛻膜中的表達(dá) 例

3 討論

在胚胎植入和胎盤形成的過(guò)程中，滋養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)與浸潤(rùn)、胎盤與子宮內(nèi)膜血管的構(gòu)建以及胎盤浸潤(rùn)蛻膜組織的行為與腫瘤組織的浸潤(rùn)性生長(zhǎng)過(guò)程相似。滋養(yǎng)細(xì)胞具有高度增殖和浸潤(rùn)性生長(zhǎng)的潛能;但在正常妊娠過(guò)程中，滋養(yǎng)細(xì)胞不發(fā)生過(guò)度增殖和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，提示可能受到細(xì)胞直接或間接分子調(diào)控作用，使滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)性生長(zhǎng)的能力維持生理性動(dòng)態(tài)平衡。母-胎界面滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)能力在分子水平的調(diào)控可以影響胚泡正常的植入和生長(zhǎng)。正常妊娠時(shí)胎盤形成后滋養(yǎng)細(xì)胞即停止侵入，如滋養(yǎng)細(xì)胞繼續(xù)浸潤(rùn)則將形成滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤。滋養(yǎng)細(xì)胞通過(guò)其自身和子宮胎盤單位產(chǎn)生的生長(zhǎng)因子、激素等進(jìn)行著精確的調(diào)控，使其侵襲具有嚴(yán)格的時(shí)間性和空間性，限制于孕早期及子宮壁的1/3處。

Survivin在大多數(shù)腫瘤組織及多種具有分化潛能的細(xì)胞中表達(dá)。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，人及其他哺乳類動(dòng)物胚胎組織、造血干細(xì)胞、分泌期子宮內(nèi)膜、早期絨毛以及蛻膜等增殖活躍的組織均有Survivin表達(dá)［2］，其他的已分化組織一般不表達(dá)或弱表達(dá)。Survivin基因的表達(dá)對(duì)于生物體早期胚胎發(fā)育起著十分重要的作用，抑制處于胚胎發(fā)育早期的Survivin基因的表達(dá)，往往造成生物體畸形發(fā)育。Fest等［3］發(fā)現(xiàn)Survivin在促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和胎盤形成的過(guò)程中起重要作用。馮苗等［4］發(fā)現(xiàn)，Survivin在正常早孕絨毛組、葡萄胎組、侵蝕性葡萄胎組、絨癌組的表達(dá)由弱至強(qiáng)。在早期妊娠絨毛及葡萄胎滋養(yǎng)層中，Survivin在細(xì)胞核中表達(dá)水平高于細(xì)胞漿;而在侵蝕性葡萄胎、絨癌滋養(yǎng)細(xì)胞中，Survivin在細(xì)胞漿及細(xì)胞核表達(dá)水平相同;說(shuō)明Survivin的過(guò)度表達(dá)勢(shì)必產(chǎn)生異常的抗凋亡作用，從而增強(qiáng)滋養(yǎng)細(xì)胞的侵蝕性。隨著Survivin表達(dá)水平的增加，妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞從正常發(fā)展為可控的良性腫瘤，再由良性向不可控的惡性腫瘤轉(zhuǎn)化。孟海云等［5］也發(fā)現(xiàn)Survivin在不同類型滋養(yǎng)細(xì)胞中均有表達(dá)，并隨著滋養(yǎng)細(xì)胞惡性程度的增加，染色程度顯著升高。

許多細(xì)胞因子均可誘導(dǎo)Survivin基因的表達(dá)。VEGF、血管生成素1可以通過(guò)激活A(yù)kt/PKB信號(hào)途徑，提高Survivin基因在細(xì)胞中的表達(dá)，從而在血管生成過(guò)程中抑制細(xì)胞凋亡，維持血管內(nèi)皮細(xì)胞的存活。近來(lái)大量實(shí)驗(yàn)研究表明在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的過(guò)程中VEGF與Survivin起著關(guān)鍵性的作用，二者的表達(dá)相關(guān)。VEGF在受精卵著床過(guò)程中發(fā)揮重要作用，并參與整個(gè)妊娠期間胎盤生長(zhǎng)過(guò)程中的血管形成，妊娠后胎盤組織VEGFmRNA表達(dá)與外周血中VEGF水平均有明顯上升［6］。Ma ACh等［7］在研究斑馬魚胚胎發(fā)育時(shí)發(fā)現(xiàn)，注射人VEGF蛋白可使Survivin的表達(dá)增加，而應(yīng)用VEGF受體抑制因子能明顯減少血管生成和抑制Survivin的表達(dá)。

但也有一些研究發(fā)現(xiàn)，Survivin基因的上游啟動(dòng)片段中存在Stat3的反應(yīng)元件，阻斷Stat3信號(hào)將會(huì)抑制Survivin的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。有研究表明白細(xì)胞介素-11(IL-11)可以通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物及激活劑3(Stat3)來(lái)促進(jìn)Survivin的表達(dá)，且其mRNA水平的提高與IL-11存在劑量依賴關(guān)系［8］。Kim等［1］研究推測(cè)Stat3可能從上位調(diào)節(jié)Survivin的表達(dá)，共同作用于抑制細(xì)胞的凋亡過(guò)程;Schlette等［9］也發(fā)現(xiàn)Survivin是Stat3傳導(dǎo)通路中的目的基因，Stat3基因的激活與Survivin基因的表達(dá)相關(guān);Garcia等［10］檢測(cè)了同種基因的低流產(chǎn)鼠、流產(chǎn)鼠和壓力刺激流產(chǎn)鼠模型母-胎界面的Survivin和Stat3的表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)Survivin在流產(chǎn)鼠和壓力鼠模型孕7.5 d時(shí)均高表達(dá)，而在正常孕鼠則為低表達(dá);認(rèn)為小鼠植入窗期母-胎界面Survivin高表達(dá)而p-Stat3低表達(dá)與鼠流產(chǎn)相關(guān)。

23號(hào)非轉(zhuǎn)移性基因H1型(nm23-H1)是經(jīng)典的腫瘤細(xì)胞侵襲抑制基因。Nm23-H1在母-胎界面促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞和蛻膜基質(zhì)細(xì)胞間交叉對(duì)話及滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲行為的控制機(jī)制中起重要作用。侯曉帆等［11］從mRNA和蛋白水平分析絨毛與蛻膜組織的nm23-H1表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，自然流產(chǎn)患者絨毛及蛻膜nm23-H1表達(dá)水平明顯高于正常早孕期;認(rèn)為人早孕期母-胎界面nm23-H1高表達(dá)可能導(dǎo)致妊娠失敗。

本研究顯示RSA患者絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞中Survivin、VEGF的表達(dá)水平高于正常對(duì)照組(P＜0.05)，二者在絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞中的表達(dá)呈正相關(guān)(P＜0.05);RSA組與正常對(duì)照組的絨毛中Stat3的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，Survivin與Stat3的表達(dá)不存在相關(guān)關(guān)系(r=-0.006，P＞0.05)。研究發(fā)現(xiàn)，VEGF通過(guò)上調(diào)Survivin，參與胚胎著床、胎盤生長(zhǎng)和浸潤(rùn);而Stat3與其無(wú)相關(guān)關(guān)系，孕早期絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞中Survivin的上調(diào)可能不通過(guò) JAK-STAT3途徑。提示 Survivin和VEGF的過(guò)度表達(dá)打破了母-胎界面滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲調(diào)控的動(dòng)態(tài)平衡，可能導(dǎo)致了胚胎被機(jī)體免疫系統(tǒng)誤認(rèn)為異常增生而啟動(dòng)調(diào)節(jié)機(jī)制，增加腫瘤細(xì)胞侵襲抑制基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致自然流產(chǎn)的發(fā)生，而Stat3在RSA絨毛中的正常表達(dá)，不會(huì)使滋養(yǎng)細(xì)胞持續(xù)過(guò)度增殖，發(fā)展為滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤。

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