中華竹鼠混合感染巴氏桿菌和大腸埃希菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

黨 龍，黃曉鳳＊，韓衛(wèi)杰，劉曉華，蔣新華，汪志如

（1.江西省林業(yè)科學(xué)院，江西南昌330032；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，江西南昌330045）

中華竹鼠是集肉用和藥用為一身的野味上品，市場(chǎng)需求量大。中華竹鼠主要分布在廣西、廣東、福建、安微、貴州、云南等地［1］。近年來(lái)，由于過(guò)渡捕獵、生境破壞，野生中華竹鼠資源急劇減少。同時(shí)疾病的發(fā)生，尤其是細(xì)菌性疾病對(duì)中華竹鼠養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的危害。本研究從江西某中華竹鼠養(yǎng)殖場(chǎng)采取具有典型癥狀的病鼠樣品，經(jīng)細(xì)菌分離鑒定、藥敏試驗(yàn)及治療等環(huán)節(jié)，以期為中華竹鼠養(yǎng)殖過(guò)程中疾病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來(lái)源 采集江西省某中華竹鼠養(yǎng)殖場(chǎng)具有典型癥狀病鼠的心臟、肺臟、肝臟、脾臟和糞便，并冷藏處理。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 鮮血瓊脂平板培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂平板培養(yǎng)基參照姚火春［2］的方法進(jìn)行配制；潔霉素、卡那霉素、阿莫西林、新霉素、慶大霉素、頭孢噻吩、鏈霉素、先鋒霉素Ⅳ和環(huán)丙沙星等藥敏片購(gòu)自江西省人民醫(yī)院；微量生化反應(yīng)管為于杭州微生物試劑有限責(zé)任公司產(chǎn)品。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明小鼠，體重18g～20g，購(gòu)自南昌大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)病情況觀察 觀察臨床表現(xiàn)，并對(duì)死亡中華竹鼠進(jìn)行剖檢，觀察其病里變化。

1.2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng) 采取病死竹鼠的肝、脾、肺、心和糞便，分別接種于鮮血瓊脂平板培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂平板培養(yǎng)基，37℃恒溫箱培養(yǎng)，24h后觀察［3］。1.2.3 革蘭染色鏡檢 分別挑取鮮血瓊脂平板和麥康凱平板上的單菌落涂片，革蘭染色，顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)特點(diǎn)。

1.2.4 生化試驗(yàn) 細(xì)菌的生化鑒定參照姚火春［2］等的方法進(jìn)行。將分離的細(xì)菌分別接種到鮮血瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)18h～24h，挑取單菌落到微量生化反應(yīng)管中，觀察結(jié)果。

1.2.5 動(dòng)物接種試驗(yàn) 將分離純化的1株巴氏桿菌和1株大腸埃希菌分別制成懸液。取18g～20g小鼠30只分成3組，每組10只，分別腹腔注射0.5 mL／只，濃度為5 000個(gè)／mL的巴氏桿菌菌液和大腸埃希菌菌液，對(duì)照組注射0.5mL／只生理鹽水。每日觀察小鼠的臨床癥狀，發(fā)現(xiàn)病死小鼠，立即無(wú)菌解剖和細(xì)菌分離。

1.2.6 藥敏試驗(yàn) 取2種分離培養(yǎng)菌進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，按照藥敏試紙說(shuō)明進(jìn)行判斷。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀和病理變化

病鼠食欲不振，精神沉郁，體溫升高，糞便黏稠呈綠色粘于肛門(mén)。病理解剖可見(jiàn)腹部、頸部皮下有不同程度的淤血、出血；胸腔、腹腔積有大量渾濁液體；肝臟、脾臟腫大，有出血點(diǎn)；肺出血、瘀血；腎臟大面積出血；腹股溝淋巴結(jié)、腸系膜水腫；真胃空虛，幽門(mén)部、十二指腸、空腸、回腸彌漫性充血、出血，內(nèi)容物暗黑稀糊狀，大腸臌氣、出血（圖1～圖4）。

圖1 心、肝、肺出血淤血Fig.1 Hemorrhage and blood stasis in heart，liver and lungs

圖2 腸系膜水腫Fig.2 Mesenteric edema

圖3 大腸臌氣Fig.3 Air-agitation in large intestine

圖4 腎臟出血Fig.4 Hemorrhage in kidney

2.2 細(xì)菌分離

在鮮血瓊脂平板培養(yǎng)基上可見(jiàn)一種為約2mm～3mm大小的光滑、隆起、灰白色、半透明、露珠樣不溶血的小菌落（圖5）。在麥康凱瓊脂平板培養(yǎng)基上長(zhǎng)出形態(tài)為圓形、光滑、濕潤(rùn)、邊緣整齊粉紅色菌落（圖6）。

圖5 鮮血瓊脂上的巴氏桿菌Fig.5 Pasteurella multocida on blood agar

圖6 麥康凱培養(yǎng)基上的大腸埃希菌Fig.6 Escherichia coli on MacConkey agar

2.3 染色鏡檢

從平板上挑起涂片，革蘭染色，鏡檢為革蘭陰性，可見(jiàn)兩端鈍圓、兩極濃染的橢圓形小桿菌，疑為巴氏桿菌；革蘭陰性、染色均一、兩端鈍圓的短桿菌疑為大腸埃希菌（圖7，圖8）。

圖7 顯微鏡下的巴氏桿菌Fig.7 Pasteurella multocida under light microscope

圖8 顯微鏡下的大腸埃希菌Fig.8 Escherichia coli under light microscope

2.4 生化試驗(yàn)

由表1可見(jiàn)生化特性與多殺性巴氏桿菌基本一致，根據(jù)是否產(chǎn)生硫化氫，可以判定其為多殺性巴氏桿菌。表2生化特性與大腸埃希菌基本一致，因此可以確定為大腸埃希菌。

2.5 動(dòng)物接種試驗(yàn)

小鼠巴氏桿菌組在接種10h出現(xiàn)精神沉郁，小鼠大腸埃希菌在接種18h出現(xiàn)精神沉郁癥狀，兩組接菌小鼠在2d內(nèi)發(fā)生死亡，對(duì)照組未死亡。在死亡小鼠的心、肝、血液內(nèi)均分離出了純細(xì)菌培養(yǎng)物。經(jīng)生化鑒定，證明從小鼠體內(nèi)分離得到巴氏桿菌和大腸埃希菌。

表1 巴氏桿菌生化鑒定表Table 1 Biochemistry identification of Pasteurella

表2 大腸埃希菌生化鑒定表Table 2 Biochemistry identification of Escherichia coli

2.6 藥敏試驗(yàn)

依據(jù)CLSI藥敏試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)［4］，本次分離的大腸埃希菌只對(duì)先鋒霉素和環(huán)丙沙星敏感，對(duì)氯霉素中度敏感，其他的藥物不敏感；分離巴氏桿菌對(duì)頭孢噻吩和環(huán)丙沙星敏感，其他藥物均不敏感，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The results of antimicrobial sensitivity test

2.7 防治

加強(qiáng)對(duì)走道和籠舍的消毒。用百毒殺液每月兩次，火焰消毒籠舍，用干燥的稻草鋪墊竹鼠籠舍。調(diào)整日糧的營(yíng)養(yǎng)水平，添加多維和環(huán)丙沙星粉劑，全群飼喂預(yù)防。發(fā)病竹鼠肌肉注射環(huán)丙沙星針劑，連用3 d，用藥后竹鼠逐漸康復(fù)，全群未出現(xiàn)新增病例。

3 討論

通過(guò)細(xì)菌分離、生化試驗(yàn)、動(dòng)物試驗(yàn)、藥敏試驗(yàn)等證實(shí)該竹鼠養(yǎng)殖場(chǎng)的急性死亡由巴氏桿菌、大腸埃希菌混合感染引起。中華竹鼠死亡原因主要是由于籠舍剩料和糞便等未及時(shí)清理，部分墊料在本舍或鄰舍的循環(huán)使用造成二次污染，同時(shí)該養(yǎng)殖場(chǎng)接納了較多的參觀人員，未消毒進(jìn)場(chǎng)也是引起該病的重要原因。

藥敏試驗(yàn)表明，病原菌對(duì)很多治療中未使用的藥物也產(chǎn)生耐藥性，這可能與平時(shí)飼料中添加復(fù)合抗生素有關(guān)，導(dǎo)致一般藥物無(wú)效，造成感染不斷擴(kuò)大，導(dǎo)致急性死亡。

中華竹鼠大腸埃希菌?。?-8］和巴氏桿菌?。?-10］的診治已有報(bào)道，但兩者混合感染的報(bào)道本文是首次。在藥物的敏感性上也略有不同，這可能與細(xì)菌的血清型和養(yǎng)殖場(chǎng)平時(shí)用藥有關(guān)。

［1］ 陳夢(mèng)林，韋詠梅.竹貍高產(chǎn)絕招秘術(shù)［M］.廣西南寧：廣西南寧廣香彩印廠，2000.

［2］ 姚火春.獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí)指導(dǎo)［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2005.

［3］ 李建強(qiáng)，李六金.獸醫(yī)微生物學(xué)試驗(yàn)實(shí)習(xí)指導(dǎo)［M］.陜西西安：陜西科學(xué)出版社，1999.

［4］ M100-S12，Performance standards for antimicrobial susceptibility testing：21st informational supplement［S］.CLSI：wayne，PA，2011.

［5］ 曾元根，鄧治邦.中華竹鼠大腸桿菌病診斷與防治［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2002，22（3）：94-95.

［6］ 王書(shū)權(quán)，何得肆.O141型大腸桿菌引起竹鼠水腫病的診治［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2011（7）：121-122.

［7］ 顏運(yùn)秋，尹得明，黎滿香.中華竹鼠水腫病的診斷與治療［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31（7）：124-125.

［8］ 屈孝初，李文平.中華竹鼠水腫病的首次診療研究［J］.特產(chǎn)研究，2002（2）：16-18.

［9］ 甘書(shū)鉆，磨美蘭，陸維和.一起竹鼠巴氏桿菌病的診斷與防治［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2008，29（11）：113-115.

［10］ 劉 歡，蘇丹萍，陳敏鴻，等.竹鼠巴氏桿菌病的診治［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2009，36（10）：165-168.