復(fù)方氟康唑軟膏臨床藥效試驗(yàn)

張瑞麗，郝智慧，侯加法，劉元元，崔亮亮，邱 梅

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院，山東青島266111；2.青島康地恩藥業(yè)股份有限公司，山東青島266061；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇南京210095）

近年來(lái)，寵物飼養(yǎng)逐年增多。寵物犬、貓?jiān)趲Ыo每個(gè)家庭諸多快樂(lè)的同時(shí)，耳道疾病的頻發(fā)卻引起人們?cè)S多煩惱，因犬貓耳部結(jié)構(gòu)褶皺多毛，日常護(hù)理難度大，如經(jīng)常忽略清潔或護(hù)理不徹底，犬貓耳部污垢多會(huì)大量滋生細(xì)菌、真菌［1-2］，感染耳螨、疥、蚤等外寄生蟲(chóng)，引發(fā)愛(ài)寵搔癢、皮炎及外耳炎等，并繼發(fā)性產(chǎn)生惡劣的異味。通過(guò)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，耳部真菌、細(xì)菌治療的方法較多，但大體分為局部和全身用藥［3-6］，局部制劑刺激性小，對(duì)角質(zhì)浸透力和抑制真菌作用強(qiáng)，內(nèi)服制劑的作用相對(duì)比較緩慢，但作用持久療效好。對(duì)慢性的真菌、細(xì)菌感染，局部用藥尤為廣泛。而國(guó)內(nèi)、外市場(chǎng)上用于治療耳部和皮膚感染的藥物較少。

在考察寵物藥市場(chǎng)的需求的基礎(chǔ)上，我們研制了一種用于治療寵物耳道真菌、細(xì)菌感染的藥物-復(fù)方氟康唑軟膏，主要成分為氟康唑、硫酸新霉素、曲安奈德。其中氟康唑具有廣譜抗真菌作用，硫酸新霉素為廣譜高效抗生素，曲安奈德為抗炎藥物，可以消除中耳黏膜腫脹。目前國(guó)內(nèi)外還未有與3種藥物相同組方的制劑。為進(jìn)一步驗(yàn)證該藥的療效和可能的不良反應(yīng)，提出科學(xué)的給藥方案和注意事項(xiàng)，進(jìn)行了人工感染和自然感染臨床藥效試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)藥品與試劑 復(fù)方氟康唑軟膏（青島康地恩藥業(yè)有限公司研制，批號(hào)：20081021），耳膚靈（法國(guó)威隆，批號(hào)20070516），營(yíng)養(yǎng)肉湯，20g／L瓊脂LB培養(yǎng)基，SDA真菌培養(yǎng)基（不添加瓊脂），犬貓皮膚真菌快速診斷培養(yǎng)基（南京仕必得生物有限公司，批號(hào)080518），KOH（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)080218），瑞氏染料（伊紅：上海三愛(ài)思試劑有限公司，批號(hào)：080622；美藍(lán)：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：F20081123）。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 Ⅱ期臨床試驗(yàn)動(dòng)物為健康中華田園犬80只，18月齡～24月齡，購(gòu)自江蘇省宿遷市豫區(qū)蔡集鎮(zhèn)犬養(yǎng)殖場(chǎng)。Ⅲ期臨床試驗(yàn)動(dòng)物為南京某流浪犬收容所（犬場(chǎng)甲）、南京某流浪犬收容所（犬場(chǎng)乙）、無(wú)錫某流浪犬收容所（犬場(chǎng)丙）內(nèi)收留2個(gè)月以上的流浪犬。

1.2 方法

1.2.1 病原液的制備 將人工培養(yǎng)的含金黃色葡萄球菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯（臨床分離株，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院微生物教研組提供）、含有馬拉色菌的SDA培養(yǎng)基（臨床分離株，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院內(nèi)科教研組提供），置于滅菌燒杯內(nèi)，加生理鹽水稀釋至每毫升含5×108個(gè)細(xì)菌、5×104個(gè)真菌孢子。

1.2.2 試驗(yàn)用動(dòng)物的處理及分組 人工感染臨床試驗(yàn)動(dòng)物麻醉后用鐵絲鉤分別在右耳垂直外耳道內(nèi)劃3道長(zhǎng)約2cm的傷口，傷口深度以劃破耳道表皮為宜，用注射器吸取病原液（制備見(jiàn)1.2.2）1mL注入垂直外耳道內(nèi)。人工感染1周后，有31條試驗(yàn)犬耳道有炎性分泌物，時(shí)常甩頭、撓耳，有明顯感染癥狀。2周后增至47只，3.5周時(shí)增至55只。根據(jù)感染嚴(yán)重程度相似原則分為5組：空白對(duì)照組10只，耳膚靈組10只，推薦劑量減半組10只，推薦劑量組15只，推薦劑量加倍組10只。自人工感染3.5周開(kāi)始用藥試驗(yàn)。

自然感染臨床試驗(yàn)動(dòng)物為犬場(chǎng)甲、乙、丙3個(gè)場(chǎng)所的流浪犬，收留2個(gè)月以上，挑選有耳部感染癥狀病犬進(jìn)行試驗(yàn)。每個(gè)犬場(chǎng)根據(jù)癥狀相似原則，選取30只病犬做耳膚靈試驗(yàn)組，60只做復(fù)方氟康唑試驗(yàn)組。

1.2.3 給藥方案 用止血鉗夾持棉球，清理完耳道內(nèi)分泌物。將藥物擠進(jìn)注射器內(nèi)，接上橡膠軟管，插入耳內(nèi)，擠適量藥膏進(jìn)入耳道，再進(jìn)行耳根按摩，使藥物涂抹均勻。

人工感染臨床治療：耳膚靈1次／d，每次0.5 mL；復(fù)方氟康唑1次／d，推薦劑量減半組每次0.25 mL，推薦劑量組每次0.5mL，推薦劑量加倍組每次1mL，連續(xù)治療6周。

自然感染臨床治療：耳膚靈、復(fù)方氟康唑軟膏均1次／d，每次0.5mL，連續(xù)治療6周。

1.2.4 病原檢查方法

1.2.4.1 真菌的檢查 將患耳分泌物無(wú)菌接種到犬貓皮膚真菌快速診斷培養(yǎng)基，室溫培養(yǎng)5d后，如有絮狀物即為真菌感染，如沒(méi)有即沒(méi)有真菌。挑取真菌壓片，根據(jù)《真菌鑒定手冊(cè)》［7］和《真菌的形態(tài)與分類(lèi)》［8］中馬拉色菌的生長(zhǎng)形態(tài)、菌落性狀、色澤、菌絲、孢子等形態(tài)特征來(lái)鑒定是否有馬拉色菌存在。

1.2.4.2 致病菌的檢查 將患耳分泌物接種于20 g／L瓊脂LB培養(yǎng)基，37℃溫箱培養(yǎng)18h～24h，觀察有無(wú)金黃色菌落［9-10］。

1.2.5 療效判定 根據(jù)病犬搔抓耳部、搖頭甩耳，耳道內(nèi)滲出物，耳道表皮增生及耳部是否有壓痛感等臨床癥狀和試驗(yàn)室檢查進(jìn)行評(píng)估，判斷病犬的治療情況。臨床療效一般分為痊愈、顯效、好轉(zhuǎn)、無(wú)效，具體評(píng)估方法如下：

痊愈：癥狀消失，試驗(yàn)室檢查病原體呈陰性。

顯效：癥狀消失大于或等于60%，試驗(yàn)室檢查病原體呈陰性。

好轉(zhuǎn)：癥狀消失20%～60%，試驗(yàn)室檢查病原體呈陽(yáng)性。

無(wú)效：癥狀消失小于20%，試驗(yàn)室檢查病原體呈陽(yáng)性。

加重：癥狀消失小于0。

如果試驗(yàn)組治愈率加顯效率均大于等于90%，且與耳膚靈治愈率加顯效率相比無(wú)顯著差異或顯著高于之，則判定該藥有效。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 所得數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，通過(guò)卡方檢驗(yàn)與空白對(duì)照組之間進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 人工感染臨床試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 臨床觀察結(jié)果 根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)［11-14］，空白對(duì)照組臨床癥狀基本未見(jiàn)改變，試驗(yàn)犬耳部感染嚴(yán)重，分泌物較多，時(shí)常甩頭、撓耳。耳膚靈組、推薦劑量減半組、推薦劑量組、推薦劑量加倍組用藥后，癥狀大多得到明顯改善，試驗(yàn)犬撓耳、甩頭癥狀逐漸減少，分泌物也逐漸減少，部分試驗(yàn)犬臨床癥狀消失，部分試驗(yàn)犬癥狀有顯著改善，部分試驗(yàn)犬癥狀有所改善，未見(jiàn)癥狀加重病例（表1）。

2.1.2 耳部病原菌檢查結(jié)果 在用藥后第7、14、21、28、35、42天，采耳部病料，進(jìn)行感染病原學(xué)檢查，如發(fā)現(xiàn)葡萄球菌或／和馬拉色菌則為陽(yáng)性，以確定患耳道內(nèi)病原是否消失（表2）。

2.1.3 綜合療效判定 根據(jù)臨床觀察結(jié)果和病原檢查結(jié)果，在用藥后第42天綜合判定療效，與空白對(duì)照組進(jìn)行卡方檢驗(yàn)（表3）。

2.2 自然感染臨床試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 臨床觀察結(jié)果 耳膚靈組和氟康唑組用藥后，癥狀大多得到明顯改善，試驗(yàn)犬撓耳、甩頭癥狀逐漸減少，分泌物也逐漸減少，6周后絕大部分試驗(yàn)犬都已恢復(fù)正常，臨床癥狀基本消失，未見(jiàn)無(wú)效和加重現(xiàn)象（表4）。

2.2.2 耳部病原菌檢查結(jié)果 在用藥后第7、14、21、28、35、42天，采耳部病料，進(jìn)行病原學(xué)檢查，如發(fā)現(xiàn)細(xì)菌、真菌感染則為陽(yáng)性，以確定患耳道內(nèi)病原是否消失（表5）。

2.2.3 綜合療效判定 根據(jù)臨床觀察和病原檢查結(jié)果，在用藥后42d綜合判定療效，與空白對(duì)照組進(jìn)行卡方檢驗(yàn)（表6）。

表1 人工感染犬治療后臨床癥狀觀察結(jié)果Table 1 Results of clinical symptoms in artificially infected dogs after treatment單位：只

表2 人工感染犬治療后病原菌檢查結(jié)果Table 2 The in results of pathogen detection in artificially infected dogs after treatment單位：只

表3 人工感染犬綜合療效判定結(jié)果Table 3 The results of comprehensive treatment efficacy in artificially infected dogs

表4 自然感染犬治療后臨床癥狀觀察結(jié)果Table 4 Observation of clinical symptoms in naturally infected dogs after treatment單位：只

表5 自然感染犬治療后病原菌檢查結(jié)果Table 5 Test results of pathogen detection in naturally infected dogs after treatment單位：只

3 討論

復(fù)方氟康唑軟膏主要有效成分為氟康唑、新霉素和曲安奈德。其中，氟康唑?yàn)槿蝾?lèi)抗真菌新藥，具有抗真菌譜廣、口服吸收完全、組織器官內(nèi)濃度較高、不良反應(yīng)小、臨床療效好等優(yōu)點(diǎn)，國(guó)外已廣泛用于臨床，是一極有前景的抗真菌藥物。氟康唑?qū)τ谥委熒畈空婢腥咎貏e是白色念珠菌及新型隱球菌有顯著療效，是目前用于治療深部真菌病的重要抗真菌藥之一。新霉素為堿性物質(zhì)，常用其硫酸鹽，易溶于水，耐熱，抗菌范圍與卜那霉素相似。因其對(duì)腎、耳毒性較強(qiáng)，且能阻滯神經(jīng)肌肉接頭，抑制呼吸，故一般不作全身應(yīng)用。新霉素對(duì)金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌、大腸埃希菌及流行性感冒桿菌有抑制生長(zhǎng)的作用，為一中等廣度的抗生素。曲安奈德屬于腎上腺皮質(zhì)激素及促腎上腺皮質(zhì)激素，作用與去炎松相似，其抗炎和抗過(guò)敏作用較強(qiáng)且遠(yuǎn)較持久。曲安奈德多用于局部用藥，對(duì)骨關(guān)節(jié)病、肌肉損傷等消炎、止痛作用；它還可用于多種皮膚病，尤其是神經(jīng)皮炎、肥厚性癱痕、皮膚淀粉樣變性等；對(duì)變態(tài)反應(yīng)性病，如過(guò)敏性鼻炎、支氣管哮喘等有一定的療效。因此，3種藥物組方可以達(dá)到抗細(xì)菌，抗真菌，抗炎癥的效果。

表6 自然感染犬臨床綜合療效判定結(jié)果Table 6 Results of comprehensive treatment efficacy in naturally infected dogs

本品人工感染臨床藥效試驗(yàn)主要針對(duì)人工細(xì)菌和真菌感染，試驗(yàn)結(jié)果顯示，復(fù)方氟康唑軟膏和耳膚靈對(duì)犬人工細(xì)菌和真菌外耳道感染均有較好的治療效果，兩者療效相似，差異不顯著。0.5mL和1.0mL復(fù)方氟康唑軟膏，每天治療1次，連續(xù)用藥4周，對(duì)由真菌和細(xì)菌引起的耳道感染治愈率＋顯效率均大于等于90%，且與空白對(duì)照組相比，差異極顯著（P＜0.01），因此可以用于犬耳道真菌和細(xì)菌感染的治療。

自然感染臨床藥效試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，復(fù)方氟康唑軟膏對(duì)耳道感染的治愈率＋顯效率均大于90%，復(fù)方氟康唑軟膏和對(duì)照組耳膚靈對(duì)犬外耳道感染治療的效果差異不顯著，但有優(yōu)于耳膚靈的趨勢(shì)，這可能是因?yàn)榉颠虻目拐婢Ч獌?yōu)于耳膚靈中的制霉菌素。氟康唑高度選擇性干擾真菌細(xì)胞色素P-450活性，從而抑制真菌細(xì)胞膜上麥角固醇的生物合成，發(fā)揮抗真菌作用；制霉菌素是多烯類(lèi)的抗真菌藥，與真菌細(xì)胞膜上的甾醇相結(jié)合，致細(xì)胞膜通透性的改變，導(dǎo)致重要細(xì)胞內(nèi)容物漏失而發(fā)揮抗真菌作用。與制霉菌素相比，氟康唑的抗菌譜更廣、抗菌效果更強(qiáng)［9］，因此其治療效果也更好。

綜上所述，復(fù)方氟康唑軟膏以每天每次0.5 mL／耳的劑量，連續(xù)治療4周的給藥方案，對(duì)由真菌和細(xì)菌引起的外耳道感染有較好的治療作用，可以在臨床上推廣使用。

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