犢牛大腸桿菌病病原的分離鑒定

尚婷婷，張耀相，林 青＊，朱 磊

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌712100，2.榆林市榆陽區(qū)青云鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)工作站，陜西榆林719000，3.榆林市榆陽區(qū)畜牧獸醫(yī)局，陜西榆林719000）

犢牛大腸桿菌病是由致病性大腸埃希菌（也稱大腸桿菌）引起的新生犢牛的一種急性傳染病，因其主要臨床癥狀是腹瀉，排出灰白色稀便，故又稱犢牛白痢。大腸埃希菌廣泛地分布于自然界，動(dòng)物出生后很短時(shí)間即可隨乳汁或其他食物進(jìn)入胃腸道，成為條件性致病菌，新生犢牛當(dāng)其抵抗力降低或發(fā)生消化障礙時(shí)，既可引發(fā)該病。本病主要發(fā)生于10日齡以內(nèi)的犢牛，特別是1日齡～3日齡的犢牛最易感。臨床特征以急性腹瀉、脫水和酸中毒為主，病犢多因腹瀉、脫水、衰竭和酸中毒而死亡，也有表現(xiàn)敗血癥狀的。病牛和帶菌牛是最重要的傳染來源，主要傳播途徑是消化道，子宮內(nèi)感染和臍帶感染也有發(fā)生。本病一年四季均可發(fā)生，但以冬春兩季多見，有時(shí)呈地方性流行［1-3］。本病發(fā)病率和死亡率因有無繼發(fā)和并發(fā)感染、飼養(yǎng)管理水平、環(huán)境衛(wèi)生條件、采取措施是否及時(shí)有效而差異較大［4］。

2011年1～3月份，陜西省楊凌示范區(qū)某奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生了新生犢牛以嚴(yán)重腹瀉、脫水等臨床癥狀的疾病，發(fā)病者多為生后1～3個(gè)月的犢牛，有的來不及用藥即發(fā)生死亡，也有的犢牛用過多種藥物，但治療無效。經(jīng)臨床初步診斷為犢牛大腸埃希菌引起的腹瀉病，筆者擬對(duì)發(fā)病犢牛進(jìn)行致病性大腸埃希菌分離鑒定，并對(duì)分離菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，為臨床合理選擇藥物，有效防治犢牛大腸埃希菌性腹瀉病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基 普通肉湯、普通瓊脂培養(yǎng)基、SS瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)、三糖鐵瓊脂斜面、伊紅美藍(lán)瓊脂平板、MH培養(yǎng)基（藥敏試驗(yàn)用培養(yǎng)基）等均按文獻(xiàn)［5］的方法制備。4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 生化試劑與生化試驗(yàn)培養(yǎng)基 革蘭染色液，各種糖發(fā)酵管，MR試劑，VP試劑，30mL／L H2O2，明膠溶液，硝酸鹽還原試驗(yàn)用甲液和已液，檸檬酸鹽試劑，吲哚試驗(yàn)試劑，4g／L酚紅水溶液（三糖鐵斜面、尿素培養(yǎng)基指示劑），10g／L溴麝香草酚藍(lán)酒精溶液（檸檬酸鹽培養(yǎng)基指示劑），16g／L溴甲酚紫酒精溶液（糖培養(yǎng)基指示劑），藥敏片購于上海醫(yī)華醫(yī)學(xué)科技有限公司，批號(hào)20041116。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明系小鼠21只，18g～22g，由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 無菌采集病料 將滅菌棉拭子在滅菌生理鹽水中潤濕，從楊凌某發(fā)病養(yǎng)牛場(chǎng)疑似細(xì)菌腹瀉病發(fā)病犢牛的直腸內(nèi)采取糞便樣品，共5份，置4℃冰箱，待檢。

1.2.2 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 將采集到的糞便樣品接種于普通瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板和鮮血瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24h。挑取血平板呈明顯β溶血的中等大小光滑菌落，接種于普通肉湯增菌，置37℃溫箱培養(yǎng)16h～18h，然后將培養(yǎng)物分別劃線接種于麥康凱瓊脂平板和鮮血瓊脂平板進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，24 h后挑取平板上可疑菌落抹片染色鏡檢。

1.2.3 可疑菌落的挑純培養(yǎng)與菌種的保存 在經(jīng)過37℃培養(yǎng)24h后，挑取麥康凱平板上的紅色菌落以及血平板上有溶血現(xiàn)象的典型菌落涂片染色鏡檢。結(jié)果與先前所觀察到的細(xì)菌進(jìn)行比較后，如相同則挑取生長典型的菌落接種到普通瓊脂斜面上進(jìn)行純培養(yǎng)（37℃，24h）；不同則重新接種培養(yǎng)。將經(jīng)普通斜面培養(yǎng)基37℃，24h培養(yǎng)物置4℃冰箱保存，以便作進(jìn)一步的鑒定。

1.2.4 生物學(xué)特性的觀察 將分離到的純培養(yǎng)物分別接種于普通肉湯培養(yǎng)基、普通平板、血平板、麥康凱平板、伊紅美藍(lán)瓊脂以及SS瓊脂培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，觀察其生長表現(xiàn)。

1.2.5 生化試驗(yàn) 對(duì)挑純的菌株分別進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)、MR、VP試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、明膠試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、三糖鐵瓊脂斜面試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、精氨酸雙水解酶、鳥氨酸脫羧酶和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)等生化試驗(yàn)。培養(yǎng)48h～96h后觀察結(jié)果。

1.2.6 抗生素敏感性試驗(yàn) 將大腸埃希菌純培養(yǎng)物接種于營養(yǎng)肉湯，37℃培養(yǎng)24h，用滅菌生理鹽水稀釋使其渾濁度在所給比濁管范圍之內(nèi)。然后用滅菌棉簽插入經(jīng)稀釋的普通肉湯培養(yǎng)物中，棉簽沿管壁滾動(dòng)，擠去多余液體，用含菌棉簽從平板中央開始涂抹，然后再轉(zhuǎn)90°涂布，使整個(gè)平板表面涂布上菌，再用滅菌鑷子將含抗生素紙片放入平板內(nèi)并壓實(shí)，每個(gè)平板上放5個(gè)紙片，置37℃溫箱培養(yǎng)24h后取出，測(cè)量抑菌環(huán)直徑。

所用的藥敏片有：氨芐青霉素、菌必治、氧氟沙星、妥布霉素、頭孢呋肟、鏈霉素、利福平、先鋒必、先鋒噻肟、慶大霉素、環(huán)丙沙星、先鋒V、苯唑青霉素、氯霉素、阿米卡星、頭孢拉定、呋喃妥因、青霉素G、復(fù)方新諾明、氧哌嗪青霉素、卡那霉素、萬古霉素、四環(huán)素、氟哌酸、復(fù)達(dá)欣、紅霉素等。

結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：直徑小于15mm為耐藥，15 mm～20mm為中度敏感，大于20mm為高度敏感［5］。

1.2.7 動(dòng)物致病性試驗(yàn) 取健康小鼠21只，隨機(jī)分成兩組，一組為試驗(yàn)組18只，另一組為對(duì)照組3只。試驗(yàn)組小鼠用一定濃度的肉湯純培養(yǎng)物0.2mL進(jìn)行腹腔注射，給對(duì)照組的小鼠用等量的滅菌普通肉湯腹腔注射。接種后進(jìn)行隔離飼養(yǎng)。觀察，記錄小鼠的精神情況與死亡情況。

2 結(jié)果

2.1 分離菌在各種培養(yǎng)基的生長情況及分離菌的鏡檢特征

從所采集的5份病料中分離出6株菌，分別編號(hào)為SY1～SY6。所有分離菌在普通瓊脂平板為中等大小、圓形凸起、邊緣整齊、表面光滑濕潤、半透明的灰白色菌落，直徑約2mm～3mm；在綿羊血平板上生長良好，為中等大小圓形菌落，β溶血較明顯；在麥康凱瓊脂平板上為中等大小、圓形凸起、邊緣整齊、表面光滑濕潤的磚紅色露滴樣菌落；在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上形成黑色帶金屬閃光的圓形菌落；在SS瓊脂培養(yǎng)基上不生長；普通肉湯培養(yǎng)基中呈均勻渾濁，有的管底有白色黏性沉淀。

所分離菌涂片在顯微鏡下可見革蘭陰性、中等大小直桿菌，兩端鈍圓，成對(duì)或散在排列，無芽胞，有微莢膜，部分有兩極著色現(xiàn)象。

根據(jù)以上特征，初步確定致病菌為腸桿菌科埃希菌屬的大腸埃希菌。

2.2 生化鑒定結(jié)果

從生化試驗(yàn)結(jié)果可以看出，6株菌均符合大腸埃希菌的生化反應(yīng)特性。分離的6株細(xì)菌都能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖和乳糖，并產(chǎn)酸產(chǎn)氣，部分菌株不分解蔗糖；均不產(chǎn)生硫化氫，不分解尿素，不利用檸檬酸鹽；硝酸鹽還原試驗(yàn)陽性；吲哚和甲基紅試驗(yàn)（MR）均為陽性，VP試驗(yàn)為陰性，由此可判定分離菌株為大腸埃希菌。

2.3 抗生素敏感性試驗(yàn)結(jié)果

該菌對(duì)菌必治、氧氟沙星、先鋒必、先鋒噻肟、環(huán)丙沙星、氯霉素、阿米卡星、卡那霉素、氟哌酸高度敏感；對(duì)妥布霉素、頭孢呋肟、先鋒V、頭孢拉定、呋喃妥因中度敏感；對(duì)氨芐青霉素、鏈霉素、利福平、慶大霉素、苯唑青霉素、青霉素G、復(fù)方新諾明、氧哌嗪青霉素、萬古霉素、四環(huán)素、復(fù)達(dá)欣、紅霉素耐藥。

2.4 動(dòng)物致病性試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)過24h后觀察，注射了SY1、SY2、SY5和SY6肉湯純培養(yǎng)物的小鼠均發(fā)病死亡，而注射了SY3和SY4肉湯純培養(yǎng)物的小鼠發(fā)病但未死亡，對(duì)照組小鼠未見任何癥狀。死亡小鼠死前均可見精神萎靡、被毛蓬松、尾巴和腹部發(fā)鉗、厭食、四肢僵直直至死亡。解剖死亡和發(fā)病未死亡的小鼠后發(fā)現(xiàn)，肺部有出血點(diǎn)，肝臟、脾臟有不同程度的水腫，通過病變組織抹片染色鏡檢后可以觀察到與之前分離培養(yǎng)到的相同的細(xì)菌。無菌采取肝臟、脾臟病料，涂片，革蘭染色、鏡檢，并進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，所得結(jié)果與病料分離菌相同。

2.5 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

根據(jù)菌落的大小、形態(tài)、顏色、邊緣狀況、表面隆起度、透明度等，細(xì)菌染色后的特性、大小、形態(tài)、結(jié)合生化試驗(yàn)結(jié)果，通過查閱文獻(xiàn)［6-11］，證實(shí)致病菌為腸桿菌科埃希菌屬的大腸埃希菌。由此可以確定，該牛場(chǎng)犢牛腹瀉病主要是由致病性大腸埃希菌引起的細(xì)菌性腹瀉。結(jié)合藥敏試驗(yàn)，臨床可首選氟哌酸、氧氟沙星、菌必治、先鋒噻肟等藥物進(jìn)行治療。

表1 分離菌株生化試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The results of biochemical test of isolated bacteria

3 討論

經(jīng)過糞便革蘭染色和微生物學(xué)診斷確定，從腹瀉犢牛病料中分離到的菌株大多是大腸埃希菌，其中5份糞樣中都確定是大腸埃希菌感染，可見引發(fā)該牛場(chǎng)犢牛腹瀉的病原菌主要是大腸埃希菌。結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查和臨床診斷，可以確診該牛場(chǎng)發(fā)生的為犢牛大腸埃希菌引起的腹瀉病。

犢牛腹瀉的因素很多，包括營養(yǎng)不良或者是由大腸埃希菌、沙門菌、綠膿桿菌、輪狀病毒、隱性孢子蟲等致病微生物單獨(dú)感染或者混合感染引起。本次試驗(yàn)并沒有分離到沙門菌、綠膿桿菌、隱性孢子蟲等。由于時(shí)間及試驗(yàn)條件的限制，是否還有輪狀病毒混合感染還需做進(jìn)一步的研究。

動(dòng)物致病性試驗(yàn)結(jié)果表明，分離到的大腸埃希菌毒力較強(qiáng)，可使小鼠的發(fā)病率達(dá)100%，死亡率達(dá)67%。

本次分離到的6株致病性大腸埃希菌因條件所限最終沒有確定其血清型，尚待進(jìn)一步研究。在實(shí)際生產(chǎn)中，我們可以根據(jù)血清型試驗(yàn)確定致病菌的血清型，并進(jìn)行抗原制備，從而進(jìn)行免疫預(yù)防。大腸埃希菌的血清型復(fù)雜多樣，優(yōu)勢(shì)血清型也存在差異，因此篩選地區(qū)性免疫原性優(yōu)良的菌株制作菌苗，是免疫預(yù)防的基礎(chǔ)［12］。近些年來，為了控制和預(yù)防某些細(xì)菌感染，在飼料添加劑及治療中常盲目使用一些抗菌藥物，導(dǎo)致產(chǎn)生許多耐藥菌株。大腸埃希菌易產(chǎn)生對(duì)抗生素的耐受性。由藥敏試驗(yàn)結(jié)果可見，致病菌對(duì)氯霉素、菌必治、氧氟沙星、阿米卡星及卡那霉素等高度敏感；對(duì)妥布霉素、呋喃妥因和復(fù)達(dá)欣等中度敏感；對(duì)鏈霉素、慶大霉素、氨芐青霉素、利福平、復(fù)方新諾明、萬古霉素、四環(huán)素及紅霉素等耐藥，這可能與該場(chǎng)長期或大量使用該類藥物，使致病菌已產(chǎn)生耐藥性有關(guān)。因此，應(yīng)當(dāng)通過藥敏試驗(yàn)確定敏感藥物。同時(shí)在藥物防治方面，不要盲目的長期大劑量使用某種藥物，以免造成耐藥菌株的出現(xiàn)。臨床治療時(shí)，建議先進(jìn)行藥敏試驗(yàn)選出高敏藥物，并注意配合補(bǔ)液、收斂等對(duì)癥療法以提高治療效果。

通過本試驗(yàn)，筆者有一些體會(huì)，希望能對(duì)臨床診斷有所借鑒。在本試驗(yàn)中病原菌的分離是個(gè)關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。在病原菌的分離鑒定中，應(yīng)時(shí)刻注意無菌操作，以保證分離到病原菌的純培養(yǎng)物。采集病料時(shí)，應(yīng)采取含病原菌最多的組織或具有明顯病變的組織，以保證能順利分離到病原。待檢材料應(yīng)該放到滅菌容器中，整個(gè)取材過程要求無菌操作。能否獲得純培養(yǎng)，在很大程度上取決于分離技術(shù)。在接種時(shí)要使用盡可能少的待檢材料，使所含細(xì)菌細(xì)胞在培養(yǎng)基上盡可能的分散開，這樣才有利于形成很多的單個(gè)菌落，從而順利獲得純培養(yǎng)。

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