呋塞米注射液細菌內(nèi)毒素檢查法的建立

(河南省食品藥品檢驗所，河南 鄭州 450003)

呋塞米注射液為利尿藥，在2005年版《中國藥典(二部)》收載的質(zhì)量標準中無熱原檢查項。為了加強質(zhì)量控制，筆者對呋塞米注射液中細菌內(nèi)毒素檢查法的可行性進行了研究。

1 儀器與試藥

DC－3A型干式恒溫器(南京三愛斯技術開發(fā)有限公司)。呋塞米注射液(山西晉新雙鶴藥業(yè)有限責任公司，規(guī)格為2 mL∶20 mg，批號為200907131;天津金耀氨基酸有限公司，規(guī)格為2 mL∶20 mg，批號為0907162;陜西京西藥業(yè)有限公司，規(guī)格為2 mL∶20 mg，批號為0904201;鄭州羚銳制藥股份有限公司，規(guī)格為2 mL∶20 mg，批號為0906281);鱟試劑(湛江安度斯生物有限公司，規(guī)格為0.5 mL，批號分別為 0902132，0710262，靈敏度分別為 0.125，0.5 EU/mL;福州新北生化工業(yè)有限公司，規(guī)格為0.5 mL，批號為08020912，靈敏度為0.5 EU/mL;湛江博康海洋生物有限公司，規(guī)格為 0.5 mL，批號為 0901122，靈敏度為 0.125 EU/mL);細菌內(nèi)毒素工作標準品(以下簡稱WSE，中國藥品生物制品檢定所，效價為120 EU/支，批號為150601－200862);細菌內(nèi)毒素檢查用水(以下簡稱BET用水，中國藥品生物制品檢定所，規(guī)格為10 mL，批號為W2008－4)。

2 方法與結果

2.1 鱟試劑標示靈敏度(λ)的復核

依法[1]對試驗用鱟試劑進行靈敏度復核。結果4批鱟試劑靈敏度測試值(λc)均在0.5～ 2.0 λ之間，表明鱟試劑靈敏度符合規(guī)定，可用于試驗。

2.2 樣品內(nèi)毒素限值(L)的確定

按照2005年版《中國藥典(二部)》相關方法[1]，根據(jù)公式L=K/M，[K為每人每公斤體重每小時最大可接受的內(nèi)毒素劑量，注射劑 K=5 EU/(kg×h);M為每人每公斤體重每小時的最大供試品劑量]，參照該藥品說明書及《臨床用藥須知》[1－2]，滴注速度每分鐘不超過 4 mg，得 M=4.0 mg(kg×h)，則 L=1.2 EU/mg。

2.3 樣品預干擾試驗

由于所用鱟試劑的靈敏度(λ)為0.5 EU/mL，則樣品的最大有效稀釋倍數(shù)(MVD)=CL/λ=24(倍)，采用不超過最大有效稀釋倍數(shù)即 3，6，12，24 倍的溶液(質(zhì)量濃度分別為 3.3，1.7，0.8，0.4 g/L)作為供試品陰性對照(NPC)管，根據(jù)使用鱟試劑的靈敏度，在其中分別添加2 λ的細菌內(nèi)毒素，制成供試品陽性對照(PPC)管，用 λ=0.5 EU/mL的鱟試劑，分別與4個系列溶液反應，各重復2管，同時作陰性對照(NC)和陽性對照(PC)各2管，做2個批號樣品預干擾試驗[1，3]，結果見表1?？梢?，呋塞米注射液稀釋至0.8 g/L時，不再對試驗產(chǎn)生干擾。

表1 干擾預試驗結果

2.4 供試品正式干擾試驗

使用鱟試劑，將呋塞米注射液稀釋12倍(0.8 g/L)，進行正式干擾試驗[1，3]。結果見表 2?？梢?，4 批樣品的 12 倍稀釋液(0.8 g/L)對兩個廠家的鱟試劑干擾試驗，結果內(nèi)毒素標準品水溶液反應終點濃度的幾何平均值(Es)為 0.5 ～2.0 λ(包括 0.5 λ 和 2.0 λ)，內(nèi)毒素供試品溶液反應終點濃度的幾何平均值(Et)為0.5～2.0 Es(包括 0.5 Es和 2.0 Es)，說明該樣品稀釋 12 倍后確已排除干擾作用。

2.5 樣品細菌內(nèi)毒素檢查

取4個批號樣品，用BET用水分別溶解稀釋制成0.8 g/L溶液，用鱟試劑 λ為0.125 EU/mL，按檢查法進行操作和結果判斷，以 L為1.2 EU/mg作為評定標準，結果見表3?？梢?，4個批號的呋塞米注射液采用兩個廠家生產(chǎn)的鱟試劑作細菌內(nèi)毒素檢查[1，4]，結果均小于限值(1.2 EU/mg)。

表2 干擾試驗結果

3 討論

呋塞米注射液工藝處方中使用的輔料有氫氧化鈉、氯化鈉、亞硫酸鈉、甲醛合次硫酸氫鈉、依地酸二鈉等，不同生產(chǎn)企業(yè)的輔料使用情況存在差異。本試驗充分考慮到了這種差異，選取了有代表性的4個廠家的呋塞米注射液，基本排除了不同處方工藝的影響。

由預干擾試驗和正式干擾試驗結果可知，呋塞米注射液在稀釋至0.8 g/L及以下濃度與靈敏度為0.5 EU/mL的鱟試劑反應無干擾影響，本品可以采用細菌內(nèi)毒素檢查法進行質(zhì)量控制，其細菌內(nèi)毒素檢查項可擬訂為“每1 mg呋塞米中含內(nèi)毒素的量應小于 1.2 EU”。

表3 樣品的細菌內(nèi)毒素檢查結果

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)[M].北京:化學工業(yè)出版社，2005:附錄ⅪE.

[2]國家藥典委員會.臨床用藥須知(化學藥和生物制品卷)[M].北京:化學工業(yè)出版社，2005:329.

[3]中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗標準操作規(guī)范[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2005:287.

[4]張廣偉，周繼春.尼可剎米注射液細菌內(nèi)毒素檢查法的建立[J].中國藥業(yè)，2010，19(6):32－33.