復(fù)方玄駒片微生物限度檢查的方法學(xué)驗(yàn)證

(浙江省紹興市食品藥品檢驗(yàn)所，浙江 紹興 312071)

復(fù)方玄駒片以螞蟻為主藥，佐以淫羊藿、枸杞子、蛇床子等藥，具有溫腎、壯陽(yáng)、益精、祛風(fēng)濕的功效，用于治療功能性陽(yáng)痿、前列腺炎、男性不育及風(fēng)濕等癥[1]。根據(jù)其用途、成分和制法，按2010年版《中國(guó)藥典(一部)》微生物限度檢查法[2]，應(yīng)進(jìn)行細(xì)菌數(shù)、霉菌及酵母菌數(shù)測(cè)定，并對(duì)控制菌－大腸埃希菌和沙門菌進(jìn)行檢查。現(xiàn)按規(guī)定建立微生物限度檢查方法，并加以驗(yàn)證。

1 試驗(yàn)材料

復(fù)方玄駒片(施強(qiáng)藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)為20090101，20090102，20090103);營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基(BL)、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基、4－甲基傘形酮葡萄糠苷酸培養(yǎng)基(MUG)、四硫磺酸鈉亮綠基礎(chǔ)培養(yǎng)基(TTB)、膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基(DHL)、曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基(EMB)均購(gòu)自北京三藥科技開發(fā)公司;氯化鈉蛋白胨緩沖液(pH=7.0，杭州微生物試劑有限公司)。大腸埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102]、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus aureus)[CMCC(B)26003]、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63501]、白色念珠菌(Candida aibicans)[CMCC(F)98001]、黑曲霉菌(Aspergillus niger)[CMCC(F)98003]、乙型副傷寒沙門菌(Salmonella paratyphi B)[CMCC(B)50094]均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備

大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌及沙門菌取于35℃培養(yǎng)24 h的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物，白色念珠菌取于25℃培養(yǎng)48 h的改良馬丁培養(yǎng)物，黑曲霉菌取于25℃培養(yǎng)7 d的改良馬丁瓊脂培養(yǎng)物，加入含0.05%聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液5 mL，洗下孢子置無(wú)菌試管中。以上菌懸液用含0.05%聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液按10倍遞增稀釋法，稀釋至菌數(shù)約為50～100 cfu/mL，備用。

2.2 供試液制備

取供試品10 g，加入pH為7.0的無(wú)菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液至100 mL，用磁力攪拌器攪拌使藥片溶解分散，作為1∶10的供試液。

2.3 回收率預(yù)試驗(yàn)

為確定細(xì)菌、霉菌和酵母菌菌落數(shù)的測(cè)定方法，按照2010年版《中國(guó)藥典》規(guī)定的試驗(yàn)菌株分別用常規(guī)法(0.5 mL/皿)、培養(yǎng)基稀釋法(0.2 mL/皿)對(duì)供試品進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)。

常規(guī)法:取2.2項(xiàng)下制備的供試液1 mL和2.1項(xiàng)下制備的菌液1 mL，分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，依法培養(yǎng)，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。結(jié)果，試驗(yàn)組中大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、沙門菌、白色念珠菌及黑曲霉菌回收率均大于70%，達(dá)到2010年版《中國(guó)藥典》要求。金黃色葡萄球菌的回收率小于70%，采用培養(yǎng)基稀釋法對(duì)細(xì)菌計(jì)數(shù)作進(jìn)一步預(yù)試驗(yàn)。

培養(yǎng)基稀釋法:取供試液1 mL等量注入2個(gè)平皿，每個(gè)平皿注入0.5 mL，同時(shí)每個(gè)平皿注入金黃色葡萄球菌菌液1 mL，立即傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，依法培養(yǎng)，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。結(jié)果金黃色葡萄球菌的回收率小于70%。采用每個(gè)平皿注入0.2 mL，用同種方法操作，結(jié)果金黃色葡萄球菌的回收率大于70%，加收率達(dá)到2010年版《中國(guó)藥典》要求。結(jié)果見表1?？梢?，供試品對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制作用，用培養(yǎng)基稀釋法(0.2 mL/皿)可消除抑制作用，使回收率符合2010年版《中國(guó)藥典》要求。

表1 供試品對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用

2.4 細(xì)菌、霉菌和酵母菌檢查方法驗(yàn)證

取3個(gè)批號(hào)的供試品，按回收率預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，細(xì)菌計(jì)數(shù)采用培養(yǎng)基稀釋法(0.2 mL/皿)，霉菌和酵母菌采用常規(guī)法，每個(gè)批號(hào)分為4個(gè)組，對(duì)供試品作細(xì)菌、霉菌和酵母菌檢查方法驗(yàn)證。結(jié)果見表2。

表2 供試品菌落數(shù)及回收率試驗(yàn)結(jié)果(%)

2.5 控制菌檢查方法驗(yàn)證[3]

試驗(yàn)組:對(duì)于大腸埃希菌，取1∶10供試液10 mL及10～100 cfu/mL大腸埃希菌菌液加入膽鹽乳糖培養(yǎng)基100 mL中，依法培養(yǎng)，按相應(yīng)的大腸埃希菌檢查方法檢查。對(duì)于沙門菌，取供試品10 g置200 mL的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，加入10～100 cfu/mL乙型副傷寒沙門菌菌液，用磁力攪拌器攪拌，使藥片溶解分散，依法培養(yǎng)。按相應(yīng)的沙門菌檢查方法檢查。結(jié)果見表3。

陰性對(duì)照組:取相應(yīng)稀釋液替代供試液，不加試驗(yàn)菌，檢查方法同試驗(yàn)組。

表3 控制菌(大腸埃希菌、沙門菌)檢查結(jié)果

陽(yáng)性對(duì)照組:取相應(yīng)試驗(yàn)菌菌液1 mL，不加供試液，檢查方法同試驗(yàn)組。

可見在控制菌檢查中，試驗(yàn)組的細(xì)菌生長(zhǎng)良好，檢出試驗(yàn)菌，陽(yáng)性對(duì)照組檢出試驗(yàn)菌，陰性對(duì)照組無(wú)菌生長(zhǎng)，故供試品的控制菌檢查可采用常規(guī)法。

3 討論

復(fù)方玄駒片為口服制劑，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，本品對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制作用，文獻(xiàn)[4]處方中蛇床子有抑制金黃色葡萄球菌的作用，這與試驗(yàn)結(jié)果基本一致。試驗(yàn)顯示，采用培養(yǎng)基稀釋法(0.2 mL/皿)可消除金黃色葡萄球菌的抑制作用，使回收率大于70%。經(jīng)驗(yàn)證確定，細(xì)菌計(jì)數(shù)采用培養(yǎng)基稀釋法(0.2 mL/皿)，霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)和控制菌檢查采用常規(guī)法，符合2010年版《中國(guó)藥典》微生物限度檢查方法的要求，可作為復(fù)方玄駒片的微生物限度檢查方法。

[1]WS3－014－2003(Z)－2008，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)[S].

[2]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄ⅩⅢC，79.

[3]中國(guó)藥品生物制品檢定所，中國(guó)藥品檢驗(yàn)總所.中國(guó)藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:351.

[4]高學(xué)敏.中藥學(xué)(供中醫(yī)藥專業(yè)用)[M].北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2002:597－598.