頂空氣相色譜法測(cè)定丁溴東莨菪堿中溶劑殘留量

李 華 ，羅超華 ，龍亞秋 ，楊 芳

(1.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院，廣東 廣州 510515;2.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣東 廣州 510515;3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510120)

丁溴東莨菪堿為M膽堿受體阻滯藥，在其生產(chǎn)過程中引入的溶劑有甲醇、乙醇、丙酮、三氯甲烷等有機(jī)溶劑，為了保證藥品的質(zhì)量和用藥安全，對(duì)該原料藥的殘留溶劑的控制顯得尤為重要。本試驗(yàn)將生產(chǎn)工藝中涉及的規(guī)定(國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)，ICH)應(yīng)控制的有機(jī)溶劑及產(chǎn)品中實(shí)際殘留的有機(jī)溶劑作為檢測(cè)對(duì)象，遵循2010年版《中國(guó)藥典(二部)》附錄“殘留溶劑測(cè)定法冶的指導(dǎo)原則[1]，采用頂空氣相色譜法，同時(shí)測(cè)定幾種有機(jī)溶劑，方法簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，重現(xiàn)性好，適用于對(duì)丁溴東莨菪堿原料藥中5種殘留溶劑的同時(shí)檢測(cè)與分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

島津GCAF－2010型氣相色譜儀，配置FID檢測(cè)器，頂空進(jìn)樣器:DANIHSS 86.50，配置20 mL頂空瓶。無(wú)水甲醇、乙醇、丙酮、三氯甲烷、乙腈、二甲基甲酰胺(DMF)均為分析純，購(gòu)于廣州化學(xué)試劑廠。丁溴東莨菪堿(成都第一制藥原料藥有限公司，批號(hào)分別為 010119，010219，010319，010419)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Agilent DB－624 柱(0.53 mm ×30 m，3 μm);柱溫:初始溫度60℃，保溫10 min;以40℃ /min升至180℃，保溫5 min;進(jìn)樣口溫度:140℃;檢測(cè)器溫度:260℃;載氣:N2;載氣流速:6 mL/min;分流比:1∶5;頂空條件:平衡溫度80℃;平衡時(shí)間30 min，進(jìn)樣針溫度85℃，加壓時(shí)間0.5 min，進(jìn)樣體積1 mL。

2.2 溶液配制

空白溶液:精密吸取純化水5.0 mL，置20 mL頂空瓶中，密封，備用;標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液 A:稱取丙酮約 0.6 g，甲醇約 0.4 g，乙醇約 0.6 g，乙腈 0.06 g，精密稱定，加入裝有 2 mL DMF 的 25 mL 容量瓶中，用水稀釋至刻度，混合均勻;標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液B:稱取三氯甲烷0.05 g，精密稱定，加入裝有2 mL DMF的100 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，混合均勻;標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液C:精密吸取2.0 mL標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液A，1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液B，置100 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，混合均勻;標(biāo)準(zhǔn)溶液:取標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液B 5.0 mL，置20 mL頂空瓶中，密封，混合均勻，平行制備6份;供試液:精密稱取樣品0.5 g，置20 mL頂空瓶中，加入5.0 mL水，密封，使溶解混合均勻。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn):將標(biāo)準(zhǔn)溶液6份，按2.1的檢測(cè)條件，連續(xù)進(jìn)樣6針，記錄色譜圖，見表1和圖1 A。結(jié)果表明，系統(tǒng)適用性良好。

表1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)數(shù)據(jù)

專屬性試驗(yàn):取空白溶液進(jìn)樣，作為溶劑空白，記錄色譜圖。溶劑DMF及水對(duì)待測(cè)溶劑的測(cè)定無(wú)明顯干擾。見圖1 B。取標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，記錄色譜圖(圖1 A)，結(jié)果甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、三氯甲烷相鄰兩相溶劑之間分離度 R 分別為 10.6，4.8，3.6，19.2，均大于3.0。可見，本試驗(yàn)的專屬性良好。見圖1 B。

重復(fù)性試驗(yàn):取標(biāo)準(zhǔn)溶液6份，連續(xù)進(jìn)樣，計(jì)算各溶劑峰面積，甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、三氯甲烷的峰面積的 RSD分別為4.5% ，3.2% ，1.2% ，2.5% ，2.6% ，均小于 10.0% ，表明方法的重復(fù)性良好。

線性關(guān)系考察:分別取2.2項(xiàng)下的標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液A 0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL，置 100 mL 容量瓶中，另取標(biāo)準(zhǔn)貯備液B 0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL 加入上述對(duì)應(yīng)容量瓶中，加水稀釋至刻度，即得編號(hào)1～7標(biāo)準(zhǔn)溶液。由低濃度至高濃度，分別精密吸取編號(hào)1～7標(biāo)準(zhǔn)溶液5 mL，置20 mL頂空瓶中，密封，同法制備3份。設(shè)定頂空條件，在80℃平衡30 min，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。以標(biāo)準(zhǔn)溶液中甲醇、丙酮、乙醇、三氯甲烷的峰面積對(duì)其質(zhì)量濃度(以μg/mL計(jì))，進(jìn)行線性回歸，峰面積對(duì)其質(zhì)量濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.995，表明該方法的線性關(guān)系良好。結(jié)果見表2。

圖1 高效液相色譜圖

表2 線性方程及相關(guān)系數(shù)

準(zhǔn)確度試驗(yàn):取丁溴東莨菪堿樣品，研細(xì)，充分干燥，將其中殘留溶劑降至較低水平，作為樣品空白。

分別取標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液 A 1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL 至 100 mL容量瓶中，另取標(biāo)準(zhǔn)貯備液 B 0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL 加入上述對(duì)應(yīng)容量瓶中，加水稀釋至刻度，即得編號(hào)為1～5的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取20 mL頂空瓶15個(gè)，分為5組，每組3個(gè)，各精密稱取丁溴東莨菪堿樣品空白 0.50 g，另取編號(hào) 1，2，3，4，5 標(biāo)準(zhǔn)溶液各5 mL，分別加入到每組頂空瓶中，使溶解，密封，混合均勻。得到相當(dāng)于三氯甲烷、乙腈最大允許殘留限度的167%，133%，100%，67%和33%，相當(dāng)于丙酮、乙醇、甲醇限度的125%，100%，75%，50%和25%的測(cè)試溶液。精密吸取4 mL標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液A，1.5 mL標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液B至100 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，混合均勻作為標(biāo)準(zhǔn)溶液，共制備6份。取標(biāo)準(zhǔn)溶液和測(cè)試溶液進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算每個(gè)溶劑每個(gè)質(zhì)量濃度的回收率。結(jié)果甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、三氯甲烷的平均回收率分別為 98.6%，100.8%，99.9% ，98.9% ，98.6% ，均在 90.0% ～110.0% 范圍內(nèi)，表明方法的準(zhǔn)確度高。

檢測(cè)限確定:取線性關(guān)系考察項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)溶液，逐步用溶劑稀釋，得到適當(dāng)質(zhì)量濃度的溶液。在2.1項(xiàng)下色譜系統(tǒng)下分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。當(dāng)待測(cè)組分的信噪比為2～3倍時(shí)，對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為該組分的最小檢測(cè)質(zhì)量濃度，見表3。

表3 丁溴東莨菪堿殘留溶劑的檢測(cè)限數(shù)據(jù)表

2.4 樣品含量測(cè)定

取4批丁溴東莨菪堿樣品，按上述色譜方法測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算各樣品中有機(jī)溶劑殘留量。結(jié)果表明，4批樣品中甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、三氯甲烷的殘留量均低于設(shè)定認(rèn)可的限度規(guī)定。見表4。

表4 4批溶劑的殘留結(jié)果

3 討論

本試驗(yàn)選擇了Agilent DB－624毛細(xì)管色譜柱，采用程序升溫，使5種有機(jī)溶劑達(dá)到了完全分離，且在10 min內(nèi)已全部出峰，大大縮短了分析時(shí)間，提高了分析效率;選擇DMF作為溶劑，與被測(cè)的5種溶劑能互溶，不干擾被測(cè)組分的測(cè)定。

本試驗(yàn)中三氯甲烷不溶于水，可先加入一定量的DMF助溶后再加水。因?yàn)樗琼斂者M(jìn)樣系統(tǒng)的首選溶劑，水中不含有機(jī)溶劑，干擾較少，且在FID檢測(cè)器上、以水為溶劑時(shí)，各殘留溶劑的靈敏度最高。專屬性方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明，DMF未造成干擾。

頂空時(shí)間要確保供試品溶液的氣－液相達(dá)到平衡，可通過測(cè)定頂空時(shí)間與頂空氣體濃度－時(shí)間曲線來(lái)確定，頂空時(shí)間不宜過長(zhǎng)，一般為30～45 min。如果過長(zhǎng)，可能引起頂空氣瓶的氣密性變差，導(dǎo)致定量的準(zhǔn)確性降低，如果時(shí)間不夠，那么就不能保證氣－液兩相達(dá)到平衡。經(jīng)試驗(yàn)摸索，本試驗(yàn)選擇了30 min。

藥品中有機(jī)溶劑殘留量檢測(cè)盡管有很多報(bào)道，但不同的藥品測(cè)定的種類各異[2]。甲醇等5種溶劑均為合成過程中使用而且在2010年版《中國(guó)藥典(二部)》中要求檢查的對(duì)人體有害的有機(jī)溶劑。因此，檢測(cè)丁溴東莨菪堿原料藥中這5種溶劑的殘留，對(duì)于丁溴東莨菪堿的質(zhì)量控制和安全使用有著十分重要的意義。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(二部)[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄ⅧP.

[2]韓學(xué)靜，袁志芳，杜玉民，等.毛細(xì)管氣相色譜法測(cè)定間尼索地平有機(jī)溶劑殘留量[J].藥物分析雜志，2009，29(9):1 193－1 195.