白吉慶,王小平,盛 艷,李雙俊
(1.陜西中醫(yī)學(xué)院,陜西 咸陽(yáng) 712046; 2.陜西省洛南縣科學(xué)技術(shù)局,陜西 商洛 726100)
九節(jié)菖蒲為毛茛科植物阿爾泰銀蓮花 Anemone altaica Fisch.ext C.A.Mey.的干燥根莖,又名節(jié)菖蒲、小菖蒲、京玄參、菊形雙瓶梅等,具有開(kāi)竅化痰、醒脾安神功效,主要用于熱病神昏、癲癇、神經(jīng)官能癥、耳鳴耳[1],主產(chǎn)于河南、山西、陜西、甘肅和內(nèi)蒙古等地[2-3]。九節(jié)菖蒲在《藥物出產(chǎn)辨》和《中國(guó)藥物標(biāo)本圖影》中均被視為石菖蒲的偽品,而在1963年版和1977年版《中國(guó)藥典(一部)》以及《中藥材手冊(cè)》《中藥大辭典》《中藥志》等均以正品收載[3]。九節(jié)菖蒲主要含有琥珀酸、棕櫚酸、5-羥基-4-氧化戊酸、β-谷甾醇、銀蓮花素(白頭翁素)、蔗糖、皂苷[4-6]等。筆者建立了九節(jié)菖蒲中總皂苷、腺苷和齊墩果酸的含量測(cè)定方法,為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究奠定基礎(chǔ)。
UV-2100型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海天美科學(xué)儀器有限公司);日立L-2400型高效液相色譜儀(UV檢測(cè)器、L-2130泵、EZStant色譜工作站);Sartorius電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司,精度0.01mg);SB-3200D型超聲儀(上海新芝生物技術(shù)研究所)等。齊墩果酸對(duì)照品(批號(hào)為110709-200304)、腺苷對(duì)照品(批號(hào)為110879-200202),均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供;九節(jié)菖蒲經(jīng)鑒定為毛茛科銀蓮花屬植物阿爾泰銀蓮花 Anemone altaica Fisch.ext C.A.May.的根莖,流動(dòng)相所用乙腈為色譜純,甲醇、乙醇等均為分析純。
齊墩果酸:色譜柱為 Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相為乙腈-水(92 ∶8);流速為 1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為208 nm;柱溫為室溫;進(jìn)樣量為10 μL。腺苷:色譜柱為Diamonsil C18柱(250 mm ×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相為乙腈-水(8 ∶92);流速為1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm;柱溫為室溫;進(jìn)樣量為10 μL。
精密稱取干燥至恒重的腺苷對(duì)照品適量,加甲醇使溶解,制成每1 mL含腺苷0.034 mg的腺苷對(duì)照品溶液。精密稱取干燥至恒重的齊墩果酸對(duì)照品適量,加流動(dòng)相使溶解,制成每1 mL含齊墩果酸0.045 mg的齊墩果酸對(duì)照品溶液。取九節(jié)菖蒲粉末1 g,精密稱定,置100 mL燒瓶中,加100 mL 95%乙醇,回流1 h,過(guò)濾,濾液水浴揮干,殘?jiān)眉状既芤?,? mL容量瓶中,定容至刻度,搖勻,即得供試品溶液A(用于腺苷、齊墩果酸含量測(cè)定)。取九節(jié)菖蒲粉末0.5 g,精密稱定,置100 mL燒瓶中,加40 mL 95%乙醇,回流1 h,過(guò)濾,濾液置50 mL容量瓶中,加95%乙醇至刻度,搖勻,精密吸取適量,置10 mL量瓶中,加95%乙醇至刻度,搖勻,即得供試品溶液B(用于總皂苷含量測(cè)定)。
線性關(guān)系考察[7]:精密稱取齊墩果酸對(duì)照品適量,加95%乙醇制成每 1 mL 含 2 mg 的溶液。精密吸取該溶液 0,0.8,1.6,2.4,3.2,4 mL,置具塞試管中,依次加入新配制的80 g/L香蘭素乙醇溶液0.5 mL,體積分?jǐn)?shù)為72%的硫酸溶液5 mL,搖勻,于90℃恒溫水浴上加熱10 min,立即取出并于冰水浴中冷卻15 min,取出,冷卻至室溫。以相應(yīng)試劑為空白,在530 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,以吸光度對(duì)質(zhì)量濃度線性回歸。精密吸取腺苷對(duì)照品溶液1.25,2.50,3.75,5.00,6.25 mL,分別置 10 mL 量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,各取10 μL注入液相色譜儀,按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定,記錄峰面積,以峰面積對(duì)質(zhì)量濃度線性回歸。精密吸取齊墩果酸對(duì)照品溶液 1.0,2.5,5.0,7.5,10.0 mL,分別置于10 mL量瓶中,用流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻,各取10 μL注入液相色譜儀,按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定,記錄峰面積,以峰面積對(duì)質(zhì)量濃度線性回歸。得回歸方程 Y總=8.735 7 X+0.000 6(R2=0.999 3,Y腺=2e+08X+15 544(R2=0.999 9),Y齊=2e+08X-19 604(R2=0.999 9)。
精密度試驗(yàn):精密吸取齊墩果酸(2 g/L)對(duì)照品溶液,依法測(cè)定其吸光度,連續(xù)測(cè)定5次,其吸光度的 SR為1.4%。分別精密吸取齊墩果酸(0.045 g/L)、腺苷(0.034 g/L)對(duì)照品溶液 10 μL,按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定,連續(xù)進(jìn)樣5次。結(jié)果齊墩果酸、腺苷峰面積的 RSD分別為0.4%和0.5%,表明儀器精密度良好。
穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品溶液,依法測(cè)定總皂苷含量,分別在 0,0.5,1,3,5 h 不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè),其吸光度的 SR為1.7%,表明供試品溶液在5 h內(nèi)穩(wěn)定。取同一供試品溶液10 μL,分別在 0,1,2,6,12 h注入液相色譜儀,測(cè)定腺苷的峰面積值,其含量的 RSD為0.6%,表明供試品溶液12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。取同一供試品溶液 10 μL,分別在 0,1,2,5,10 h 注入液相色譜儀,測(cè)定齊墩果酸的峰面積值,其含量的 RSD為0.7%,表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
重現(xiàn)性試驗(yàn):取同一樣品5份,依法制備供試品溶液,分別測(cè)定其吸光度,測(cè)定齊墩果酸、腺苷的峰面積值,其含量的 RSD分別為1.6%,0.4%,1.6%,表明本試驗(yàn)方法重現(xiàn)性良好。
加樣回收試驗(yàn):精密稱取已知總皂苷含量的樣品6份,精密加入一定量齊墩果酸對(duì)照品,依法測(cè)定其吸光度;精密稱取已知腺苷含量的樣品6份,精密加入一定量腺苷對(duì)照品,依法制備供試品溶液,取10 μL注入液相色譜儀,測(cè)定腺苷的峰面積值;精密稱取已知齊墩果酸含量的樣品6份,精密加入一定量齊墩果酸對(duì)照品,依法制備供試品溶液,取10 μL注入液相色譜儀,測(cè)定齊墩果酸的峰面積值,計(jì)算其回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。
取九節(jié)菖蒲樣品,按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,顯色后,依法在530 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,按2.1項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定,記錄腺苷、齊墩果酸的峰面積,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,計(jì)算總皂苷、腺苷、齊墩果酸的含量。結(jié)果見(jiàn)表2。
表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)
表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=3)
取適量對(duì)照品溶液和供試品溶液,置具塞試管中,依次加入新配制的80 g/L香蘭素乙醇溶液0.5 mL,體積分?jǐn)?shù)為72%的硫酸溶液5 mL,搖勻,于90℃恒溫水浴上加熱10 min,立即取出并于冰水浴中冷卻15 min,取出,冷卻至室溫。在400~700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。結(jié)果在530 nm波長(zhǎng)處有最大吸收,故選取530 nm波長(zhǎng)為測(cè)定波長(zhǎng)。取適量對(duì)照品和供試品溶液,在200~400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描,結(jié)果齊墩果酸在208 nm波長(zhǎng)處有最大吸收,腺苷在260 nm波長(zhǎng)處有最大吸收,故分別以此作為其檢測(cè)波長(zhǎng)。通過(guò)對(duì)多種流動(dòng)相的組成、檢測(cè)波長(zhǎng)、柱溫進(jìn)行分析比較,發(fā)現(xiàn)采用2.1項(xiàng)下的色譜條件能使色譜圖的基線平直、峰形較好,且待測(cè)成分的分離度均大于1.5。
本研究中建立了九節(jié)菖蒲主要化學(xué)成分的高效液相色譜定量分析方法,方法專屬性強(qiáng),定量精密度高,穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好,可為九節(jié)菖蒲質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究奠定基礎(chǔ)。
對(duì)供試品溶液制備方法進(jìn)行比較,結(jié)果表明,回流提取法所得總皂苷、齊墩果酸、腺苷含量最高,超聲提取法最低,因此采用回流提取法處理樣品。
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