氨基酸前體對棘白霉素B發(fā)酵合成的影響

王耀耀，　付美紅，　朱研研，　郝惠云，　王亞莉，　張雪霞

微生物藥物國家工程研究中心，河北省工業(yè)微生物代謝工程技術(shù)研究中心，華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司，石家莊 050015

氨基酸前體對棘白霉素B發(fā)酵合成的影響

王耀耀，付美紅，朱研研，郝惠云，王亞莉，張雪霞*

微生物藥物國家工程研究中心，河北省工業(yè)微生物代謝工程技術(shù)研究中心，華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司，石家莊 050015

摘要：以構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)發(fā)酵生產(chǎn)酯肽類化合物棘白霉素B，研究棘白霉素B己肽環(huán)結(jié)構(gòu)的前體性氨基酸對產(chǎn)物的代謝影響，顯示出脯氨酸、鳥氨酸、蘇氨酸在發(fā)酵48 h補(bǔ)入，對發(fā)酵代謝有促進(jìn)作用。利用響應(yīng)面統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行前體及有機(jī)氮源配方優(yōu)化，得出優(yōu)化配方：脯氨酸4.55 mg/mL,鳥氨酸1.85 mg/mL，蘇氨酸0.97 mg/mL，棉籽粉2.62%，搖瓶發(fā)酵水平達(dá)到3 270 μg/mL，較原水平提高30.2%。新工藝在50 L罐上放大，發(fā)酵水平進(jìn)一步提高至3 520 μg/mL，顯示出良好的工業(yè)應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：棘白霉素B； 酯肽； 響應(yīng)面統(tǒng)計(jì)學(xué)方法； 氨基酸前體

阿尼芬凈是繼卡波芬凈、米卡芬凈之后開發(fā)出的又一個(gè)重要的芬凈類抗生素藥物。其合成途徑包括利用曲霉發(fā)酵獲取先導(dǎo)性化合物——棘白霉素B(ECB)，再經(jīng)脫?；コ舅醾?cè)鏈，最后進(jìn)行側(cè)鏈化學(xué)結(jié)構(gòu)改造而成藥[1]。芬凈類對近年來日益嚴(yán)重的侵襲性念珠菌感染有顯著療效[2,3]。藥物作用機(jī)理為通過非特異性抑制真菌細(xì)胞壁的β-(1, 3)-D-葡聚糖合成酶，導(dǎo)致葡聚糖合成受阻，破壞真菌細(xì)胞壁完整性，最終導(dǎo)致真菌細(xì)胞溶解死亡[4]。阿尼芬凈抗菌譜廣，對多數(shù)念珠類如白色念珠菌、熱帶念珠菌以及煙曲菌和新型隱球菌等菌屬均有抑菌或殺菌作用，特別對于唑類和兩性霉素B耐藥菌有顯著抗菌活性，沒有藥物交叉反應(yīng)。其藥物安全性高，顯著優(yōu)于傳統(tǒng)抗真菌藥物兩性霉素B[5,6]。

棘白霉素B是最早被發(fā)現(xiàn)的棘白霉素家族中第一個(gè)天然化合物[7]，由曲霉菌發(fā)酵產(chǎn)生。棘白霉素B具有典型的棘白類家族的特殊己肽環(huán)結(jié)構(gòu)，肽環(huán)的主要氨基酸組成為脯氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、亮氨酸和鳥氨酸，生物合成遵循非核糖體多肽合成途徑(NRPS)[8]。作為新一代抗真菌藥物，芬凈類抗生素得到研究工作者們的廣泛關(guān)注。研究范疇涉及化合物的化學(xué)多樣性結(jié)構(gòu)改造[9]、菌種選育[10]、生物合成[11]等眾多領(lǐng)域。有關(guān)使用構(gòu)巢曲霉進(jìn)行ECB的發(fā)酵研究，鄒樹平等人[12]對菌種進(jìn)行傳統(tǒng)遺傳育種改造，并針對發(fā)酵配方中的碳、氮、磷源進(jìn)行配方優(yōu)化；Hodges等人[13,14]對構(gòu)巢曲霉發(fā)酵代謝副產(chǎn)物柄曲霉素進(jìn)行基因敲除，從分子水平上對合成途徑進(jìn)行了揭示和討論；Cockshott等人[15,16]報(bào)道了ECB發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化后的最適工藝條件。針對ECB合成己肽環(huán)相關(guān)氨基酸對發(fā)酵代謝的研究尚無報(bào)道。

本文根據(jù)ECB生物合成途徑, 研究了不同氨基酸前體結(jié)合有機(jī)氮源對構(gòu)巢曲霉生長、代謝以及產(chǎn)物合成的影響。利用響應(yīng)面方法的統(tǒng)計(jì)學(xué)研究特點(diǎn)[17]，圍繞中心點(diǎn)進(jìn)行合理的分組設(shè)計(jì)，采用多元二次方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過方差分析確定擬合曲線的顯著性，在三維空間層面上分析氨基酸與天然有機(jī)氮源以及前體因素之間的交互影響，尋求響應(yīng)值最高點(diǎn)。前體工藝優(yōu)化使ECB發(fā)酵水平得到有效提升，為ECB的工業(yè)化放大生產(chǎn)提供了理論和數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1菌種

棘白霉素B產(chǎn)生菌(Aspergillusnidulans)NCPC1246由本研究室保藏。

1.1.2主要試劑和培養(yǎng)基

棘白霉素B的對照品(按文獻(xiàn)方法制備并標(biāo)定[18]，純度98%)；糊精(北京雙旋雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠)；馬鈴薯葡萄糖瓊脂(北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠)；硫酸銨、磷酸二氫鉀、氯化鈉等無機(jī)鹽為化學(xué)純試劑(天津瑞金特化學(xué)品有限公司)；棉籽餅粉(中棉紫光生物科技有限公司)；氨基酸(北京欣經(jīng)科生物技術(shù)公司)，甲醇(分析純)。

斜面培養(yǎng)基(g/L):馬鈴薯葡萄糖瓊脂62.5，瓊脂5。母瓶培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，硫酸銨10，棉籽餅粉15，磷酸二氫鉀5，氯化鈉5，七水硫酸鎂2，七水硫酸亞鐵1，消前pH 6.5。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：糊精35.0，葡萄糖12.0，硫酸銨20.0，棉籽餅粉30.0，磷酸二氫鉀8.0，氯化鈉5.0，七水硫酸鎂2.0，七水硫酸亞鐵1.0，碳酸鈣2.0，消前pH 6.2。培養(yǎng)基均在121 ℃下滅菌30 min。

1.1.3儀器

調(diào)速搖瓶機(jī)INNOVO5000；島津液相色譜儀LC-2010AHT；珠江牌生化培養(yǎng)箱(廣東醫(yī)療器械廠)LRH-150II；超低溫冰箱Thermo ULT1786；離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)LXJ-IIB；光學(xué)顯微鏡Olympus CX41。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)條件

斜面培養(yǎng)條件：25 ℃, 相對濕度30%～60%, 培養(yǎng)7 d～8 d。

搖瓶培養(yǎng)條件：培養(yǎng)成熟的斜面挖塊接種于裝40 mL種子培養(yǎng)基的母瓶中，25 ℃、220 r/min培養(yǎng)48 h，然后以3%接種量接入裝40 mL發(fā)酵液的發(fā)酵瓶中，25 ℃、220 r/min發(fā)酵6 d。

50 L罐培養(yǎng)條件：采用二級發(fā)酵方式，斜面接種于裝有200 mL種子培養(yǎng)基的1 L三角瓶中，25 ℃、220 r/min培養(yǎng)48 h后，以0.5%接種量接入種子罐，25 ℃培養(yǎng)，周期40 h～48 h，發(fā)酵接種量3%，發(fā)酵罐接種后發(fā)酵液體積為30 L，培養(yǎng)周期120 h～144 h，轉(zhuǎn)速300 r/min～400 r/min。

1.2.2發(fā)酵液效價(jià)檢測

取發(fā)酵液1 mL，用10倍95%乙醇浸提，超聲0.5 h，3 000 r/min離心15 min，上清液經(jīng)膜過濾進(jìn)行HPLC分析。HPLC色譜分析條件參考文獻(xiàn)[18]。

1.2.3前體考察試驗(yàn)

(1) 前體氨基酸單因素考察試驗(yàn)

以原發(fā)酵培養(yǎng)基為對照，分別在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加終濃度為1 mg/mL的脯氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、亮氨酸和鳥氨酸，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，于144 h放瓶，檢測菌體量及ECB發(fā)酵水平。

(2) 前體添加時(shí)間及劑量范圍的考察

選取對發(fā)酵代謝有促進(jìn)作用的氨基酸前體，分別在消前、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h添加氨基酸前體，檢測放瓶時(shí)ECB產(chǎn)物發(fā)酵水平。按照主要有機(jī)氮源棉籽餅粉高低兩個(gè)劑量分組，高劑量組棉籽粉3.0%，低劑量組棉籽餅粉2.0%，氨基酸劑量考察范圍為0.1 mg/mL～10 mg/mL，分組取值0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.5 mg/mL、0.8 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL、5 mg/mL、8 mg/mL和10 mg/mL，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，檢測放瓶時(shí)菌體量及ECB發(fā)酵水平。

(3) 前體氨基酸與有機(jī)氮源響應(yīng)面統(tǒng)計(jì)方法分析

使用Design-expert7.0軟件進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)，以預(yù)試驗(yàn)確定的氨基酸及有機(jī)氮源取值范圍為基礎(chǔ)，設(shè)定因素值，每因素取三個(gè)水平，通過對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析以獲取最優(yōu)方案。

2結(jié)果與討論

2.1前體氨基酸單因素影響

棘白霉素B為棘白霉素家族中具有環(huán)己肽環(huán)和脂肪酸側(cè)鏈的天然酯肽類化合物，己肽環(huán)的主要氨基酸組成為4R,5R-二羥基-L-鳥氨酸、4R-羥基-L-脯氨酸、3S,4S-二羥基-L高酪氨酸、3S-羥基-4S-甲基-L-脯氨酸、兩個(gè)L-蘇氨酸。與棘白霉素類pneumocandinA0結(jié)構(gòu)相比較，其典型差異為R7位的谷氨酰胺為蘇氨酸所取代。針對pneumocandinA0進(jìn)行的氨基酸研究顯示3S-羥基-4S-甲基-L-脯氨酸的前體為亮氨酸，而非脯氨酸[19]。所以，在試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，也選取了亮氨酸進(jìn)行前體作用考察。

如圖1所示，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加終濃度為1 mg/mL的脯氨酸、蘇氨酸、鳥氨酸，能夠提高ECB的發(fā)酵水平。與對照相比，ECB產(chǎn)量分別提高5.5%、4.7%和3.2%。添加酪氨酸使菌絲量較對照增加4.3%，但對產(chǎn)物合成促進(jìn)作用不顯著。添加亮氨酸，菌體量減少，ECB發(fā)酵水平也有所降低。

圖1　添加不同前體對ECB發(fā)酵水平的影響

2.2前體補(bǔ)料時(shí)間的影響及劑量范圍考察

對優(yōu)選出的脯氨酸、蘇氨酸和鳥氨酸在發(fā)酵前期、中期和后期進(jìn)行補(bǔ)料考察。如圖2所示，0 h～24 h補(bǔ)加三種氨基酸對發(fā)酵產(chǎn)量的影響不顯著，48 h～96 h相較對照組提高程度最為顯著。觀察構(gòu)巢曲霉菌絲形態(tài)，前期菌絲分散，呈米白色，菌體量快速增長，初級代謝特征顯著；48 h后，菌絲結(jié)球呈顆粒狀，顏色逐漸加深，營養(yǎng)利用加速，培養(yǎng)基逐漸澄清，產(chǎn)物合成速度加快。在此期間，氨基酸發(fā)揮前體促進(jìn)作用。最適補(bǔ)加時(shí)間為48 h，三種氨基酸提高比例達(dá)5.1%～8.8%。

圖2　前體氨基酸補(bǔ)料時(shí)間對發(fā)酵的影響

設(shè)定原發(fā)酵配方中主要有機(jī)氮源—棉籽餅粉分別為3.0%、2.2%，進(jìn)行氨基酸補(bǔ)料濃度范圍考察。在考察劑量范圍內(nèi)呈現(xiàn)出作用不顯著、促進(jìn)、毒性三種影響趨勢(表1)。棉籽粉3.0%時(shí)，脯氨酸優(yōu)勢表現(xiàn)集中在1.0 mg/mL～5.0 mg/mL，發(fā)酵相對效價(jià)提高8.5%～12.1%；鳥氨酸0.5 mg/mL～2.0 mg/mL時(shí)，發(fā)酵相對效價(jià)提高4.2%～7.3%；蘇氨酸0.5 mg/mL～1.0 mg/mL時(shí)，發(fā)酵相對效價(jià)提高4.9%～6.8%。在低氮條件下，雖然整體發(fā)酵水平有所下降，但是前體作用對發(fā)酵代謝的影響更加突出，脯氨酸在適宜濃度范圍發(fā)酵相對效價(jià)提高至10.6%～15.4%；鳥氨酸單因素影響發(fā)酵相對效價(jià)提高至5.7%～10.1%；蘇氨酸單因素影響發(fā)酵相對效價(jià)提高5.5%～12.4%。

表1　棉籽餅粉及氨基酸濃度對發(fā)酵產(chǎn)量的影響

2.3響應(yīng)面統(tǒng)計(jì)方法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)前體氨基酸與有機(jī)氮源配方組合

2.3.1最陡爬坡實(shí)驗(yàn)

根據(jù)優(yōu)選出的前體氨基酸脯氨酸、鳥氨酸、蘇氨酸以及原配方中有機(jī)氮源棉籽粉相互影響考察結(jié)果，設(shè)定其變化方向及步長，進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步縮小響應(yīng)面目標(biāo)區(qū)域。如表2所示，選取第4組為中心濃度。

2.3.2二次回歸曲線擬合及方差分析顯著性檢驗(yàn)

在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)之上，利用軟件design-expert 7.0進(jìn)行Box-behnken響應(yīng)面分析，設(shè)計(jì)4因素3水平試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)組24組，中心濃度組重復(fù)5次(表3、表4)。

表2　最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3　Box-behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表

表4　Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

以ECB發(fā)酵單位為響應(yīng)值，對試驗(yàn)結(jié)果作二次回歸擬合，得到二次方程：

Y=-47 759.92+1 057.70X1+4 786.07X2+6 627.67X3+31 159.50X4+182.00X1X2+372.50X1X3-191.25X1X4-545.00X2X3-905.00X2X4-106.25X3X4-137.78X12-734.60X22-3 638.12X32-5 441.25X42

方差分析結(jié)果如表5所示。擬合曲線方程概率P<0.0001，為高度顯著性影響；失擬項(xiàng)P為0.224 5，表示擬合曲線與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不符情況為不顯著；方程中各項(xiàng)X2、X3、X4、X1X2、X1X3、X2X4、X12、X22、X32、X42影響顯著；R2為0.96(表6)，調(diào)整R2為0.920 1，擬合曲線相關(guān)性好；精確度16.056，變異率2.38%，顯示試驗(yàn)精確度高，擬合二次曲線適用于本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的進(jìn)一步引導(dǎo)和優(yōu)化。

表5　回歸方程方差分析

表6　模型可信度分析

2.3.3響應(yīng)面分析及最佳培養(yǎng)基成分確定

響應(yīng)面分析結(jié)果如圖2所示，得最優(yōu)解為：脯氨酸4.55 mg/mL，鳥氨酸1.85 mg/mL，蘇氨酸0.97 mg/mL，棉籽粉2.62%，預(yù)報(bào)最大響應(yīng)值為3 094.68 μg/mL。

圖3　響應(yīng)面三維空間分析圖

工藝通氣量/(r/min)產(chǎn)量/(μg/mL)菌體量/%新工藝原工藝220315047250327052220250860250251162

2.3.4搖瓶驗(yàn)證

以優(yōu)化的氮源及前體補(bǔ)料工藝在250 mL搖瓶中進(jìn)行工藝驗(yàn)證，前體氨基酸組方于發(fā)酵48 h一次補(bǔ)入，144 h放瓶時(shí)菌體量降低至對照組的78.3%，ECB發(fā)酵水平提升至3 150 μg/mL。進(jìn)一步提高搖床轉(zhuǎn)速，增加溶氧，優(yōu)化工藝的搖瓶水平可繼續(xù)提升至3 270 μg/mL，較原工藝提升幅度達(dá)30.2%。

2.3.5罐放大試驗(yàn)

新工藝在50 L罐上進(jìn)行二級發(fā)酵放大，前期0 h～24 h通氣量1.8 m3/h，攪拌轉(zhuǎn)速300 r/min，48 h以后提高通氣量為2.2 m3/h，攪拌轉(zhuǎn)速400 r/min，于48 h進(jìn)行前體組方一次性補(bǔ)料，發(fā)酵周期144 h。發(fā)酵前期菌體量增至32%。44 h～48 h菌絲漸成球狀顆粒，次級代謝啟動，效價(jià)單位快速增長，期間碳氮代謝平衡，pH維持在6.2～6.5，溶氧水平達(dá)到50%以上，顯著優(yōu)于原工藝。至放罐時(shí)，菌絲量達(dá)到40.3%，放罐單位達(dá)到3 520 μg/mL，較原工藝水平提高39.5%。

原工藝

前體補(bǔ)料工藝

3結(jié)論

根據(jù)棘白霉素B生物合成途徑，考察參與己肽環(huán)合成的5種氨基酸對構(gòu)巢曲霉的發(fā)酵代謝影響，確定了三種在發(fā)酵中表現(xiàn)為促進(jìn)作用的前體性氨基酸：脯氨酸、鳥氨酸、蘇氨酸。結(jié)合有機(jī)氮源基礎(chǔ)發(fā)酵配方，表現(xiàn)出氨基酸前體與原配方中天然有機(jī)氮源有明顯交互影響。在高氮源環(huán)境下，容易產(chǎn)生前體代謝反饋抑制。采用deaign-expert7.0軟件中響應(yīng)面統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，針對三種氨基酸和棉籽粉進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和組方優(yōu)化，得到高度顯著性的擬合二次曲線，推算出最大響應(yīng)值配方為：脯氨酸4.55 mg/mL，鳥氨酸1.85 mg/mL，蘇氨酸0.97 mg/mL，棉籽粉2.62%。搖瓶驗(yàn)證發(fā)酵水平可達(dá)3 270 μg/mL，提高幅度30.2%。50 L罐放大進(jìn)一步顯示新工藝的優(yōu)勢，表現(xiàn)為菌絲量降至對照值的78.8%，次級代謝過程中溶氧水平顯著改善，碳氮源利用平衡，放罐發(fā)酵水平達(dá)到3 520 μg/mL，較原工藝水平提高39.5%。

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Effects of amino acid precursors on echinocandin B biosynthesis

WANG Yao-yao, FU Mei-hong, ZHU Yan-yan, HAO Hui-yun, WANG Ya-li, ZHANG Xue-xia

National Engineering Research Center of Microbial Medicine;Hebei Industry Microbial Metabolic Engineering & Technology Research Center;New Drug Research & Development Company of NCPC, Shijiazhuang 050015

AbstractEchinocandin B (ECB), a lipopeptide natural product, was produced by Aspergillus nidulans strain. Biosynthesis of ECB was influenced by amino acid precursors of hexapeptide. It was showed that L-proline, L-ornithine and L-threonine could improve the synthesis of secondary metabolites, and the proper precursor feeding time was 48 h. By response surface methodology, the optimized concentrations of precursors and organic nitrogen source were obtained. The proper composition contained L-proline 4.55 mg/mL, L-ornithine 1.85 mg/mL, L-threonine 0.97 mg/mL, cottonseed meal 2.62%. Under the optimal fermentation conditions, yield of ECB reached to 3 270 μg/mL in shake flask, which increased by 30.2% compared with original level. Furthermore, a fed-batch culture in a 50 L fermentor was conducted. The yield of ECB further reached to 3 520 μg/mL, which indicated great potential in industrial applications.

Key wordsechinocandin B; lipopeptide; response surface methodology; amino acid precursors

doi:10.3969/j.issn.1001-6678.2016.02.001

基金項(xiàng)目：國家“重大新藥創(chuàng)制”科技專項(xiàng)(2014ZX09201001-002)。

作者簡介：王耀耀(1971～)，女，江蘇省泰州，高級工程師，從事生物制藥研究。E-mail:wyy711024@126.com。 *通訊作者：張雪霞，女，研究員級正高級工程師，從事天然藥物研究。Tel.:0311-86685347，E-mail:zhangxuexiazxx@163.com。