利用色譜法快速檢測分析啤酒腐敗菌的新方法

楊　超，　韓曉雪，　黃雨濛，　孫　珍

大連工業(yè)大學 生物工程學院，遼寧大連 116034

利用色譜法快速檢測分析啤酒腐敗菌的新方法

楊超，韓曉雪，黃雨濛，孫珍*

大連工業(yè)大學 生物工程學院，遼寧大連 116034

摘要：啤酒在生產過程中很容易染菌，而傳統的用于啤酒腐敗菌檢測的方法耗時長，不能滿足實際需求。由于腐敗菌污染的啤酒通過色譜檢測，相應組分(生物胺、有機酸和風味物質)都會有特征峰的產生，所以本研究通過建立無腐敗菌污染的啤酒中各組分的標準色譜圖，再使啤酒強制染菌，對其組分進行色譜分析，并與標準色譜圖進行比較，從而找出各組分對應的特征峰。未來，此方法可用于實際生產線上快速檢測啤酒是否發(fā)生微生物污染。

關鍵詞：啤酒腐敗菌； 生物胺； 有機酸； 風味物質； 色譜分析

啤酒是世界上最古老的酒精飲料，距今已有數千年的歷史[1]。啤酒是以麥芽、水為主要原料，通過添加一定量啤酒花苦味質，經啤酒酵母純種發(fā)酵釀造而成的一種低酒精度、味道獨特的酒精飲料[2]。我國啤酒的質量近年來有了大幅度的提高，特別是在啤酒的外觀、色澤、泡沫等指標上，均在世界啤酒中名列前茅[3]。

對啤酒口感影響較大的一般包括生物胺，有機酸和風味物質等。有些物質在一定含量范圍內賦予啤酒特殊口味，若含量過高便會給啤酒帶來不良的口感[4～7]。由于啤酒是我們日常生活中的常用飲品，它的口感顯得尤為重要。但是，啤酒的生產工藝較復雜，在生產過程中很容易染菌，若啤酒在生產過程中被污染，且沒被檢測出來進而投放到市場中，就會造成無法估量的經濟損失，因此，啤酒生產過程中腐敗菌的檢測顯得尤為重要，快速準確地檢測既能避免腐敗菌污染造成的經濟損失，又能很好的控制啤酒品質。傳統的腐敗菌檢測方法是通過從啤酒中分離出腐敗菌在平板上厭氧培養(yǎng)，然后通過觀察和一些生理生化試驗來判定這些腐敗菌。它的主要缺點是實驗周期長，操作繁瑣，檢測結果不夠準確[8]。目前快速檢測腐敗菌方法的研究主要有三種：(1)免疫學的檢測方法，適用于啤酒釀造過程的各個階段的樣品，其簡便、專一、易于自動化的特點預示其有較好的發(fā)展前景，但需要降低單克隆抗體的制備成本[9]。(2)ATP生物發(fā)光檢測方法，它適用于成品啤酒的微生物在線檢測，最大優(yōu)點是簡單、快速和高靈敏度[10]。(3)分子生物學檢測方法PCR及其衍生技術，它們的優(yōu)點是靈敏度高，專一性強，適于應急生產中出現的突發(fā)事件，但缺點是檢測費用高[11]。現有的快速檢測腐敗菌方法都存在一定的不足，限制其工業(yè)化應用，需要進一步改進。

在啤酒釀造過程中，產生適量的色胺、尸胺、組胺能夠改善啤酒的風味，使其口味更清爽，但是高含量的色胺、尸胺、組胺意味著釀造過程中可能受到過微生物的污染[12]。有機酸是啤酒主要的呈味物質，采用紫外檢測器，可測定啤酒中的蘋果酸、乳酸、檸檬酸等有機酸[13]。生物胺和有機酸都能用液相色譜進行分析。揮發(fā)性的風味物質主要包括醇類、酯類、醛類、酮類等，影響啤酒的感官品嘗，氣相色譜靜態(tài)頂空技術是分析啤酒中揮發(fā)性組分最簡便的方法，只需將啤酒樣品密封在頂空瓶內，在一定的溫度下平衡后便可進樣，主要的醇、醛、酯都能夠被分析出來[14]。由于腐敗菌污染的啤酒通過色譜檢測，相應組分都會有特征峰的產生，所以本研究通過建立無腐敗菌污染啤酒中各組分(生物胺、有機酸和風味物質)的標準色譜圖，再使啤酒強制染菌，對其組分進行色譜分析，并與標準色譜圖進行比較，找出各組分對應的特征峰。此方法可進一步用于實際生產線上快速檢測啤酒是否發(fā)生微生物污染。

1材料與方法

1.1實驗儀器與試劑

氣相色譜儀為Agilent-6850(頂空進樣器為Agilent-7697A)，液相色譜儀為Agilent-1260，高速冷凍離心機為HITACHI CR21 G Ⅲ，分光光度計為722s，氮吹儀為MD-200。所用啤酒為黑獅新動購自超市，乙醚、丙酮、三氯甲烷、正丁醇和谷氨酸鈉，均購自科密歐，丹磺酰氯購自上海源葉公司。

1.2實驗方法

1.2.1培養(yǎng)基配制

MRS：麥芽糖 5 g/L，蛋白胨 10 g/L，酵母浸膏 4 g/L，牛肉膏 8 g/L，葡萄糖 20 g/L，磷酸氫二鉀 2 g/L，吐溫-80 1%(v/v)，乙酸鈉 5 g/L，檸檬酸三銨 2 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，MnSO4·4H2O 0.05 g/L，pH自然。

1.2.2腐敗菌的培養(yǎng)

實驗室新分離出了五株腐敗菌：短乳桿菌(49#)，芽孢桿菌(3012#)，植物乳桿菌(JSB)，類布氏乳桿菌(白)，葡萄球菌(球)。分別將其接入MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并在其菌濃為1.0的時候接入啤酒中，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱，將一組沒接菌的MRS同時接入啤酒作為空白對照。培養(yǎng)7天后取出，進行色譜分析，檢測其生物胺，有機酸和風味物質的含量。

1.2.3樣品前處理

1.2.3.1生物胺

1.2.3.1.1樣品中生物胺的提取

將啤酒超聲除氣，離心(10 000 r/min，10 min，4 ℃)，取10 mL啤酒于燒杯中用適量的NaCl使樣品飽和，用0.1 mol/L NaOH調pH到12。取上述啤酒5 mL于15 mL離心管中，加5 mL正丁醇/三氯甲烷(體積比1∶1)，渦旋振蕩5 min，離心(3 600 r/min，10 min，4 ℃)，取上層有機相于新的試管中。重復兩次，合并萃取液。加入0.1 mL 1mol/L HCl，震蕩均勻。氮吹儀水浴吹干(40 ℃)，加1 mL 0.1 mol/L HCl，將殘留物溶解，待衍生。

1.2.3.1.2生物胺的衍生

取待衍生樣品0.5 mL于10 mL具塞試管中，加入1.5 mL飽和NaHCO3及1 mL丹磺酰氯(10 mg丹磺酰氯溶于1 mL丙酮，終濃度為10 mg/mL)，于60 ℃培養(yǎng)箱放置30 min(中間取出震蕩混勻2次)，后加入0.1 mL谷氨酸鈉(50 mg谷氨酸鈉溶于1mL飽和NaHCO3，終濃度為50 mg/mL)，60 ℃保溫15 min(中間取出震蕩混勻1次)。取出后加入1 mL超純水，混勻。氮吹儀水浴吹至3 mL(40 ℃)，加入同體積乙醚，震蕩2 min，取上層萃取液于新的15 mL離心管中。重復一次，合并萃取液，氮吹儀水浴吹干(40 ℃)。用1 mL甲醇將殘留物溶解，過0.22 μm有機濾膜后，置于4 ℃冰箱保存，以便進行液相色譜分析。

1.2.3.2有機酸

將啤酒超聲除氣，離心(10 000 r/min，10 min，4 ℃)，取1mL啤酒樣品，過0.22 μm水系濾膜，置于4 ℃冰箱保存，以便進行液相色譜分析。

1.2.3.3風味物質

用10 mL移液管準確移取10 mL啤酒樣品，加入3.0g NaCl，充分溶解于氣相頂空瓶內，置于4 ℃冰箱保存，以便進行氣相色譜分析。

1.2.3.4標準樣品的配制

1.2.3.4.1生物胺

準確稱取7種生物胺標準品(色胺，腐胺，尸胺，組胺，酪胺，亞精胺，精胺)，分別用 0.1 mol/L HCl溶液各定容至 10 mL，濃度為 100 mg/L，混勻后置于棕色試劑瓶中，4 ℃避光保存。準確量取生物胺溶液 0.05 mL、0.1 mL、0.25 mL、0.5 mL、1 mL、1.5 mL、2.5 mL和5.0 mL，用 0.1 mol/L HCl定容至 10 mL 棕色容量瓶中，混勻，使?jié)舛确謩e為0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.5 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、15.0 mg/L、25.0 mg/L、50.0 mg/L，按照上述生物胺衍生的方法去處理，進行液相色譜分析。

1.2.3.4.2有機酸

準確稱取6種有機酸(乙醛酸，酒石酸，乳酸，α-酮戊二酸，檸檬酸，蘋果酸)，分別用超純水定容10 mL，濃度為1 g/L。逐級稀釋8個梯度，按照上述有機酸樣品前處理的方法，進行液相色譜分析。

1.2.3.4.3風味物質

準確稱取10種風味物質(乙醛，甲酸乙酯，乙酸乙酯，正丙醇，異丁醇，乙酸異戊酯，正丁醇，異戊醇，2,3-丁二醇，2-苯乙醇)，分別用30%的乙醇溶液定容至100 mL，濃度為50 mg/L。逐級稀釋8個梯度，按照上述風味物質樣品前處理的方法，進行氣相色譜分析。

1.2.4色譜分析條件

1.2.4.1生物胺

色譜柱為Agilent C18(150 mm×4.6 mm×5 μm)，紫外檢測波長為254 nm，進樣量50 μL，柱溫為35 ℃，流速1.0 mL/min，流動相A為超純水，B為甲醇，梯度洗脫程序如表1，實驗重復三次。

表1　生物胺HPLC梯度洗脫程序

1.2.4.2有機酸

色譜柱為依利特C18(250 mm×4.6 mm×5 μm)，紫外檢測波長為215 nm，進樣量10 μL，柱溫為30 ℃，流速0.8 mL/min，流動相A為乙腈，B為0.01 mol/L (NH4)2HPO4-H3PO4緩沖溶液(pH 2.5)，梯度洗脫程序如表2，實驗重復三次。

表2　有機酸HPLC梯度洗脫程序

1.2.4.3風味物質

色譜柱為Agilent DB-FFAP(30 m×0.250 mm×0.25 μm)，進樣口溫度為250 ℃，檢測器溫度為250 ℃，分流比為2∶1，升溫程序：初始溫度50 ℃保持2 min，以5 ℃/min升至190 ℃，在190 ℃保持1 min，以10 ℃/min升至230 ℃，在230 ℃保持10 min。采取靜態(tài)頂空進樣的方式，實驗重復三次。

2結果與討論

2.1標準曲線的繪制

把各種標準品(生物胺，有機酸，風味物質)按照上述濃度配制，進行色譜分析，得到一系列標準品色譜圖。提取出各種物質各個濃度的峰面積，與各自對應濃度進行線性擬合，得出各自線性方程，R2均大于0.99。具體線性方程如表3，表4，表5所示。

表3　生物胺標準品對應的標準曲線(濃度為mg/L)

表4　有機酸標準品對應的標準曲線(濃度為g/L)

表5　風味物質標準品對應的標準曲線

2.2顯著性差異分析

本實驗通過使用SPSS17.0對強制染菌啤酒的色譜圖與標準色譜圖進行顯著性差異分析(P<0.05)。所有色譜圖中得到的峰面積都根據各自的標準曲線折算成對應的濃度。在這里，標準色譜圖就是對空白對照的各組分進行色譜分析得到的相應色譜圖。為了避免儀器波動產生的系統誤差的影響，三次重復實驗間各組分濃度的相對標準偏差必須小于10%。而在實際生產中，考慮到不同人員操作可能存在的系統誤差，以及釀造工藝的不穩(wěn)定性可能會造成假陽性，標準色譜圖需進行三次平行釀造，且彼此間相對標準偏差小于10%才可以確定。

接入不同腐敗菌的啤酒各組分濃度與標準色譜圖各組分濃度間的顯著性差異結果如表6，表7，表8所示。

如表6所示，接入五株不同腐敗菌的啤酒生物胺組成與標準色譜圖均有不同程度的顯著性差異，在能檢測出的七種生物胺中，49#除了精胺沒有檢測出，其它六種均與標準色譜圖有顯著性差異；3012#的腐胺，組胺和亞精胺與標準色譜圖有顯著性差異；白與標準色譜圖的顯著性差異較少，僅有腐胺和組胺；球的色胺，尸胺，組胺和精胺與標準色譜圖有顯著性差異；JSB除了酪胺與標準色譜圖沒有顯著性差異，其它六種均有。

表6　生物胺的顯著性分析

注：*表示P<0.05

如表7所示，五株菌的有機酸組成均有不同程度的顯著性差異，在能檢測出的六種有機酸中，49#的乳酸，α-酮戊二酸，檸檬酸和蘋果酸與標準色譜圖有顯著性差異；3012#與標準色譜圖均沒有顯著性差異；白的乳酸，檸檬酸和蘋果酸與標準色譜圖有顯著性差異；球和JSB與標準色譜圖的顯著性差異較少，球的乳酸和蘋果酸，JSB的檸檬酸和蘋果酸有顯著性差異。

表7　有機酸的顯著性分析

注：*表示P<0.05

如表8所示，五株菌的風味物質組成均有不同程度的顯著性差異，在能檢測出的十種風味物質中，49#的乙醛沒有檢測出，甲酸乙酯和乙酸異戊酯與標準色譜圖有顯著性差異；3012#的乙醛和乙酸乙酯與標準色譜圖有顯著性差異；白與標準色譜圖均沒有顯著性差異；球僅有乙醛與標準色譜圖有顯著性差異；JSB與標準色譜圖的顯著性差異較多，它的乙醛，甲酸乙酯，異丁醇和正丁醇均與標準色譜圖的有顯著性差異。

表8　樣品中風味物質的顯著性分析

注：*表示P<0.05

2.3各種腐敗菌種間顯著性差異分析

本實驗還對五株菌兩兩比較進行種間顯著性差異的分析，從而分析比較不同類別腐敗菌對啤酒各組分影響的差異。分析表明49#，白和JSB的顯著性差異較少，3012#和球分別與其他四株菌的顯著性差異較為明顯。實驗結果與各株菌所屬類別基本相符，因為49#，白和JSB同屬于乳桿菌，而3012#和球分別屬于芽孢桿菌和葡萄球菌?？偟膩碚f，分類比較接近的腐敗菌對啤酒各組分的影響比較接近，分類相距較遠則影響差異大。

3結論

本研究發(fā)展了一種利用色譜法快速檢測分析啤酒腐敗菌的新方法，通過建立無腐敗菌污染啤酒中生物胺，有機酸和風味物質的標準色譜圖，再對不同腐敗菌污染的啤酒組分進行色譜分析，并與相應標準色譜圖進行顯著性差異比較，從而找出各組分對應的特征峰。此方法可用于實際生產線上快速檢測啤酒是否發(fā)生微生物污染，如需進一步確認，也可結合PCR及其它分子生物檢測技術進行確認分析。

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A new method for rapid detection of beer spoilage bacteria by using chromatography

YANG Chao, HAN Xiao-xue, HUANG Yu-meng, SUN Zhen

School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China

AbstractBeer can be easily contaminated in the production process. The traditional method for detecting beer spoilage bacteria is time-consuming, which cannot meet the actual demand. The contaminated beer with spoilage bacteria can be identified with characteristic peaks by chromatographic analysis of each component (biogenic amine, organic acid and flavor compound). In this research, the standard chromatogram of each component of no spoiled beer was established and the components of the forced spoiled beer by chromatographic method were analyzed. Then the characteristic peaks of both the non-spoiled beer and the spoiled beer could be rapidly identified by comparing the chromatograms. This method could be further applied in the beer production line for rapidly detection whether the spoil bacteria happened.

Key wordsbeer spoilage bacteria； biogenic amine； organic acid； flavor compound； chromatography

doi:10.3969/j.issn.1001-6678.2016.02.007

基金項目：國家自然科學基金(31401681)，遼寧省教育廳科學研究一般項目(L2015049)。

作者簡介：楊超(1991～)，男，研究生。 *通訊作者: 孫珍(1986～)，女，博士，講師。電話：0411-86318692，E-mail: sunzhen@dlpu.edu.cn。