一株嗜熱鏈球菌產(chǎn)多糖條件的優(yōu)化

任　瑋，　夏永軍，　王光強(qiáng)，　張　匯，　熊智強(qiáng)，　艾連中

上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院， 上海 200093

一株嗜熱鏈球菌產(chǎn)多糖條件的優(yōu)化

任瑋，夏永軍，王光強(qiáng)，張匯，熊智強(qiáng)，艾連中*

上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院， 上海 200093

摘要：使用單因素和正交試驗設(shè)計相結(jié)合的方法對培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化提高嗜熱鏈球菌AR333的胞外多糖(exopolysaccharides, EPS)產(chǎn)量。獲得最佳培養(yǎng)基配方為：脫脂乳粉15% (w/v)、半乳糖1% (w/v)、大豆蛋白胨0.5% (w/v)、磷酸氫二鉀0.1% (w/v)。最佳培養(yǎng)條件為：接種量3%，40 ℃，初始pH 6.5，發(fā)酵時間16 h。優(yōu)化后嗜熱鏈球菌AR333的EPS產(chǎn)量可達(dá)256.97 mg/L，比優(yōu)化前的產(chǎn)量提高了3.6倍。

關(guān)鍵詞：嗜熱鏈球菌； 胞外多糖； 優(yōu)化

胞外多糖(exopolysaccharides, EPS):由一些特殊微生物在生長代謝過程中分泌到細(xì)胞壁外、分泌到環(huán)境中的水溶性多糖[1]。嗜熱鏈球菌屬于乳酸菌(LAB)，是食品級工業(yè)生產(chǎn)菌，其分泌的EPS在乳制品行業(yè)被公認(rèn)綠色、安全，可以直接被應(yīng)用到發(fā)酵食品中，節(jié)約工業(yè)成本[2-4]。不同嗜熱鏈球菌生產(chǎn)EPS的最佳發(fā)酵條件差異很大[5,6]。因此不同菌株產(chǎn)多糖的條件需要進(jìn)行具體探究。本實驗室已篩選出一株產(chǎn)活性黏多糖的嗜熱鏈球菌AR333，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)其所產(chǎn)EPS有利于改善發(fā)酵食品的粘度和質(zhì)地且具有免疫活性，在食品工業(yè)中具有潛在的開發(fā)價值。對AR333的產(chǎn)多糖條件進(jìn)行必要的優(yōu)化措施能夠最大化獲得自身所要得到的目標(biāo)產(chǎn)物，節(jié)約生產(chǎn)成本。影響EPS合成的因素很多，除了產(chǎn)生菌的遺傳特性、自身產(chǎn)生的能量外，還有環(huán)境因素，如培養(yǎng)基成分(碳源、氮源、無機(jī)鹽等)、培養(yǎng)基初始pH值、發(fā)酵溫度和時間、接菌量等等[4, 5]。初步優(yōu)化這些條件,以達(dá)到提高其EPS產(chǎn)量的目的。

1材料和方法

1.1菌種、試劑及培養(yǎng)基

嗜熱鏈球菌AR333由實驗室保藏。脫脂乳粉購自光明乳業(yè)股份有限公司，其他試劑均為分析純。脫脂乳培養(yǎng)基(基礎(chǔ)培養(yǎng)基)：脫脂奶粉15%(w/v)，115 ℃下滅菌20 min；最佳配方培養(yǎng)基(w/v)：脫脂乳粉15%、半乳糖1%、大豆蛋白胨1%、磷酸氫二鉀0.1%。

1.2方法

1.2.1種子液制備

挑取嗜熱鏈球菌AR333單菌落接種入1 mL的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，40 ℃下培養(yǎng)10 h作為種子液。

1.2.2發(fā)酵液中EPS含量測定

發(fā)酵液10 000 r/min，4 ℃下離心20 min，上清部分加80%的三氯乙酸溶液至終濃度4%，4 ℃靜置過夜后10 000 r/min離心20 min，上清液常溫透析72 h (每6 h換一次去離子水)[3]，然后測定EPS含量，以無菌培養(yǎng)液為空白對照。由于AR333所產(chǎn)EPS主要成分為半乳糖，因此苯酚硫酸法[7]測定EPS含量時采用半乳糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3添加不同營養(yǎng)成分對EPS產(chǎn)量的影響

發(fā)酵初始條件：基礎(chǔ)培養(yǎng)基，接種量2%(v/v)，37 ℃下培養(yǎng)24 h。

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加1.0 %與0.1 %的不同碳源(葡萄糖、果糖、麥芽糖、半乳糖、蔗糖)，種子液為活化兩代的AR333，接種量3% (v/v)，置40 ℃下培養(yǎng)16 h后測定發(fā)酵液中EPS含量。

在最優(yōu)碳源培養(yǎng)基中分別添加1.0%與0.1%的不同氮源(尿素、檸檬酸銨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨)，接種量3%，其他條件同上，測定發(fā)酵液中EPS含量。

高溫滅菌時高濃度無機(jī)鹽容易造成脫脂乳凝結(jié)，根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果選擇0.1%作為初始添加量。在最優(yōu)碳氮源培養(yǎng)基中分別添加0.1%的檸檬酸氫二胺、磷酸氫二鉀、醋酸鈉、硫酸鎂、氯化鈉。接種量3%，其他條件同上，測定發(fā)酵液中EPS含量。

1.2.4通過正交試驗確定最佳培養(yǎng)基配方

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇顯著影響菌體生長和EPS產(chǎn)量的碳源、氮源、無機(jī)鹽為正交試驗的3個影響因素，每個因素在試驗范圍內(nèi)取3個水平(表1)。以發(fā)酵液中EPS含量為試驗指標(biāo)，確定最佳培養(yǎng)基配方。正交表采用L9(34)。

表1　正交試驗設(shè)計(L9(34))

1.2.5發(fā)酵條件優(yōu)化

在確定最佳培養(yǎng)基配方的基礎(chǔ)上，對AR333產(chǎn)EPS的發(fā)酵條件(接種量、發(fā)酵溫度、初始pH、發(fā)酵時間)進(jìn)行優(yōu)化。

接種量優(yōu)化：活化兩代的AR333分別以1.0%、2.0%、3.0%、4.0%的接種量接入最佳配方培養(yǎng)基(20 mL)中，40 ℃下培養(yǎng)16 h后測定發(fā)酵液中EPS含量。

發(fā)酵溫度優(yōu)化：接種量3%，發(fā)酵溫度選擇37 ℃、40 ℃和42 ℃。

發(fā)酵初始pH優(yōu)化：接種量3%，40 ℃，初始pH選擇5.5、6.5、7.5。

發(fā)酵時間優(yōu)化：在優(yōu)化條件下，20 h內(nèi)每隔4 h取樣測定發(fā)酵液pH與EPS含量，確定最適發(fā)酵時間。

2結(jié)果與討論

2.1添加不同營養(yǎng)成分對菌株AR333產(chǎn)EPS的影響

嗜熱鏈球菌常被用作為乳品發(fā)酵劑[8-10]。文獻(xiàn)報道數(shù)據(jù)顯示，嗜熱鏈球菌的多糖產(chǎn)量可以超過50 mg/L[11]。目前菌株AR333的初始EPS產(chǎn)量即可達(dá)到71.16 mg/L，有必要采取優(yōu)化措施進(jìn)一步提高其EPS產(chǎn)量，為該菌株開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。從原料成本角度考慮，選用配方簡單的脫脂奶粉培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

2.1.1添加不同碳源對菌株AR333產(chǎn)EPS的影響

如表2所示，同基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比，添加1.0%的葡萄糖，半乳糖，蔗糖后AR333的EPS產(chǎn)量有顯著的升高。其中，添加半乳糖時EPS產(chǎn)量最高，因此選擇半乳糖為最佳碳源。

表2　添加不同營養(yǎng)成分對EPS產(chǎn)量的影響

EPS的生物合成途徑是在細(xì)胞漿內(nèi)通過糖基轉(zhuǎn)移酶將被激活的單糖從糖基-核苷酸上順序性地轉(zhuǎn)移而裝配到細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的類異戊二烯脂質(zhì)載體上，合成多糖的結(jié)構(gòu)重復(fù)單元；隨后多糖重復(fù)單元通過脂質(zhì)載體的運(yùn)載作用穿過細(xì)胞膜至細(xì)胞表面；最后在聚合酶的作用下，幾百或數(shù)千個多糖結(jié)構(gòu)重復(fù)單元聚合形成多糖[12-14]。添加半乳糖效果顯著的原因可能是AR333能夠直接將半乳糖吸收并激活進(jìn)行裝配工作，從而提高了EPS的產(chǎn)量[12]。

2.1.2添加不同氮源對菌株AR333產(chǎn)EPS的影響

在添加1%半乳糖的基本培養(yǎng)基中繼續(xù)添加1.0%的尿素、胰蛋白胨、酪蛋白胨和大豆蛋白胨，EPS產(chǎn)量繼續(xù)提升(表2)，說明添加這4種氮源有利于提高菌株AR333的多糖產(chǎn)量。其中，添加大豆蛋白胨時EPS產(chǎn)量最高，所以選擇大豆蛋白胨為最佳氮源。

2.1.3添加不同無機(jī)鹽對菌株AR333產(chǎn)EPS的影響

同未添加無機(jī)鹽的培養(yǎng)基配方比較，添加了0.1%的檸檬酸氫二胺，磷酸氫二鉀后EPS產(chǎn)量顯著升高，說明這兩種無機(jī)鹽在低濃度時適于嗜熱鏈球菌AR333的利用。添加醋酸鈉后EPS含量為(200.48±8.67)mg/L，比不添加時的(214.83±4.68)mg/L還低，可能此種濃度的醋酸鈉不利于AR333產(chǎn)多糖。添加0.1%的磷酸氫二鉀對EPS產(chǎn)量提升效果最為顯著，因此選擇以磷酸氫二鉀為最佳無機(jī)鹽。

2.2正交試驗

正交試驗設(shè)計具有優(yōu)良的均衡分散性和整齊可比性，設(shè)計的試驗點具有強(qiáng)烈的代表性，根據(jù)設(shè)計各因素的主次順序以及對實驗指標(biāo)的影響規(guī)律，往往能以較少的試驗次數(shù)，篩選出滿意的結(jié)果。從而提高實驗效率和分析質(zhì)量[15]。經(jīng)過單因素實驗，選擇了半乳糖、大豆蛋白胨、磷酸氫二鉀三因素設(shè)計正交試驗，結(jié)果如表3和圖1所示。根據(jù)極差R值可知，大豆蛋白胨是影響EPS產(chǎn)量最重要的因素，半乳糖次之，磷酸氫二鉀影響最小。此三因素最適水平分別為半乳糖添加量1.0%，大豆蛋白胨1.0%，磷酸氫二鉀0.1%。

2.3培養(yǎng)條件對菌株AR333產(chǎn)EPS的影響

2.3.1接種量對EPS產(chǎn)量的影響

表3　嗜熱鏈球菌培養(yǎng)條件正交試驗結(jié)果

圖1　正交實驗水平趨勢圖

不同接種量對EPS產(chǎn)量的影響見表4。從表中可以看出，最佳接種量為3%。

表4　不同接種量對嗜熱鏈球菌AR333 EPS

2.3.2發(fā)酵溫度對EPS產(chǎn)量的影響

發(fā)酵溫度不同，菌株的生長及其合成EPS的產(chǎn)量亦明顯不同。一般菌體濃度與合成EPS的產(chǎn)量成正相關(guān)[16]。發(fā)酵溫度過低，菌體生長緩慢，從而影響EPS的合成。發(fā)酵溫度過高，培養(yǎng)后期容易發(fā)生自溶，也會影響EPS的產(chǎn)量。

不同發(fā)酵溫度下EPS產(chǎn)量見表5。從表中可以看出，EPS產(chǎn)量在40 ℃時達(dá)到最大，低于菌體最適生長溫度42 ℃。這與前人的研究發(fā)現(xiàn)相符合，即發(fā)酵溫度低于最適生長溫度時，有利于嗜熱鏈球菌EPS的形成。較低溫度下，菌體生長速度也較慢，因此細(xì)胞壁的合成速度也減慢，從而使較多的磷酸異戊二烯被菌體用于合成EPS[17]。

表5　不同溫度對嗜熱鏈球菌AR333 EPS

2.3.3不同初始pH對EPS產(chǎn)量的影響

不同pH條件下菌株AR333產(chǎn)EPS的情況見表6。數(shù)據(jù)顯示產(chǎn)EPS的最佳初始pH為6.5。研究表明，在接近中性偏酸的pH條件下，EPS生物合成量較大[4-6, 12, 16, 18]。目前己證實，參與EPS生物合成的類異戊二烯脂質(zhì)載體的運(yùn)載最適pH值在6.5～7.0，pH值的降低會因失去脂質(zhì)載體中間體而使EPS合成受阻[19]。盡管培養(yǎng)過程中通過控制體系pH可以顯著提升EPS的產(chǎn)量，但從生產(chǎn)發(fā)酵乳制品的角度來講，卻是一個難以實現(xiàn)的限制性因素[4]。

表6　不同初始pH對嗜熱鏈球菌AR333 EPS

2.3.4最佳條件下菌株的產(chǎn)多糖曲線

初始和最佳發(fā)酵條件下EPS產(chǎn)量隨發(fā)酵時間變化趨勢見圖2。從圖中可以看出，EPS的最大產(chǎn)量出現(xiàn)在16 h附近。時間延長，EPS產(chǎn)量不再繼續(xù)提升，原因可能是多糖逐漸開始水解[4, 20]。因此最佳發(fā)酵時間選擇16 h。

2.3.5優(yōu)化前后AR333 EPS產(chǎn)量比較

在優(yōu)化后的最佳培養(yǎng)條件下培養(yǎng)16 h，菌株AR333的EPS產(chǎn)量可以提升到256.97 mg/L，比優(yōu)化前的產(chǎn)量(71.16 mg/L)提高了3.6倍。

圖2　嗜熱鏈球菌AR333的產(chǎn)多糖曲線與產(chǎn)酸曲線

3結(jié)論

(1) 可知碳源、氮源、與無機(jī)鹽種類的選擇均會對嗜熱鏈球菌AR333的EPS合成產(chǎn)生明顯影響。通過單因素實驗確定最佳碳源、最佳氮源和最佳無機(jī)鹽分別為半乳糖、大豆蛋白胨和磷酸氫二鉀。

(2) 由正交實驗可知大豆蛋白胨的添加量對菌株AR333 EPS產(chǎn)量的影響最大，半乳糖次之，無機(jī)鹽影響最小。最佳培養(yǎng)基配方為半乳糖1%、大豆蛋白胨1%、磷酸氫二鉀0.1%。

(3) 使用最佳培養(yǎng)基配方培養(yǎng)菌株AR333產(chǎn)PES，通過單因素實驗找到最佳培養(yǎng)條件為接種量3%，40 ℃，初始pH 6.5，培養(yǎng)時間16 h。

(4) 在優(yōu)化后的條件下，菌株AR333的EPS最高產(chǎn)量可達(dá)256.97 mg/L，比優(yōu)化前(接種量2%，37 ℃，自然pH，發(fā)酵時間24 h)的產(chǎn)量提高了3.6倍，成功實現(xiàn)了優(yōu)化培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的目的，為后續(xù)AR333多糖制備與研究奠定了基礎(chǔ)，對工業(yè)化利用嗜熱鏈球菌菌株發(fā)酵生產(chǎn)EPS起到一定的指導(dǎo)作用。

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Culture condition optimization ofStreptococcusthermophilesAR333 for exopolysaccharides production

REN Wei, XIA Yong-jun, WANG Guang-qiang, ZHANG Hui, XIONG Zhi-qiang, AI Lian-zhong

School of Medical Instrument and Food Engnieering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China

AbstractThe medium composition and fermentation conditions were optimized by using the single factor analysis method and the orthogonal experiment to elevate the exopolysaccharides (EPS) production of Streptococcus thermophiles AR333. The optimal composition of the medium: dried skim milk 15%, galactose 1%, soy peptone 1% and K2HPO4 0.1%. The optimal fermentation conditions were as follows: 40 ℃, inoculum size 3%, initial pH 6.5 and fermentation time 16 h. The yield of EPS produced by Streptococcus thermophiles AR333 under the optimal conditions reached 256.97 mg/L, which was 3.6-fold of that before optimization.

Key wordsStreptococcus thermophiles; exopolysaccharides; fermentation condition optimization

doi:10.3969/j.issn.1001-6678.2016.02.004

基金項目：國家自然科學(xué)基金面上項目(No.31371809)；國家自然科學(xué)基金-青年科學(xué)基金項目(No.31401670)；新世紀(jì)優(yōu)秀人才計劃(NCET-13-0901)。

作者簡介：任瑋(1990～)，女，碩士研究生，研究方向：微生物方向。E-mail:595824301@qq.com。 *通訊作者：艾連中，男，教授。E-mail:ailianzhong@163.com。