腦缺血再灌注大鼠血漿脂聯(lián)素及其組織表達(dá)的研究

周喜燕，呂以靜，李 寧，逄世敏

腦血管病中腦梗死占80%以上，生存者中的病殘率達(dá)70%～80%，嚴(yán)重危害人類的生命與健康，給社會(huì)和家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)［1］。本課題研究大鼠腦缺血再灌注前后血漿脂聯(lián)素（APN）水平與其在頸動(dòng)脈內(nèi)膜表達(dá)的變化，來探討脂聯(lián)素與腦梗死發(fā)生的關(guān)系，為腦血管病的預(yù)防與診療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 脂聯(lián)素ELISA試劑盒（美國Invitrogen公司 貨號(hào)KRP0041），脂聯(lián)素免疫組化試劑盒（英國abcam公司 貨號(hào)ab62551），二步法IHC檢測試劑（北京中杉金橋公司貨號(hào)：PV－6000－G），SABC免疫組化試劑盒/DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），內(nèi)皮素－1（ET－1，Merck公司 貨號(hào)05－23－3800－0.1 MG）。

1.2 動(dòng)物與分組 封閉群純種SPF級(jí)Sprague－Dawley（SD）雄性大鼠30只，體重180 g±20 g，自然光線，自由飲水，自由攝食條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。分別稱重標(biāo)記，采用隨機(jī)法分為A組（正常對照組）、B組（缺血再灌注組），每組15只。

1.3 動(dòng)物模型制備 參考顧國軍等［2］方法，B組復(fù)制缺血再灌注大鼠模型。俯臥位固定于腦立體定向儀上，以保溫床墊維持肛溫在（37.5±0.5）℃，在顱頂沿正中線做一長約1.5 cm的切口，暴露顱骨，以前囟為標(biāo)志，向前0.9 mm，向左旁開5.2 mm，向下8.7 mm 植入 ET－1導(dǎo)管。將 ET－1（60 pmol/μL）以0.6 μL/min的速率注射到 MCA附近，留針5 min，緩慢拔針，退針后縫合頭皮。術(shù)口局部施以消毒酒精抗感染。1.4 標(biāo)本處理及觀察指標(biāo)

1.4.1 血漿脂聯(lián)素檢測 每組大鼠于復(fù)制模型前后隨機(jī)抽取10只，依次用10%水合氯醛腹腔注射麻醉（300 mg/kg，必要時(shí)補(bǔ)充注射）后，經(jīng)眼眶采血，接取5 m L至分離膠管中，4℃，3000 r/min離心10 min，取上層血清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA法）進(jìn)行檢測，操作過程中嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。1.4.2 頸動(dòng)脈脂聯(lián)素檢測 每組大鼠于復(fù)制模型前后隨機(jī)抽取3只，分別經(jīng)水合氯醛麻醉，迅速剝離頸總動(dòng)脈，用止血鉗把周圍肌肉組織和神經(jīng)組織剝離后穿雙線，遠(yuǎn)心端結(jié)扎，近心端用動(dòng)脈夾阻斷血流，剪下頸總動(dòng)脈，縱向切開后，于生理鹽水中沖洗，放入4%多聚甲醛中，固定6 h～8 h，石蠟包埋。做3μm厚連續(xù)切片，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。

脂聯(lián)素免疫組織化學(xué)檢測：常規(guī)脫蠟至水，抗原修復(fù)，封閉內(nèi)源性過氧化物酶。蘇木素復(fù)染后，自來水返藍(lán)。脫水，透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。設(shè)置陰性對照，采用PBS代替一抗、二抗及SABC，結(jié)果為陰性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)/方差分析；方差不齊時(shí)采用秩和檢驗(yàn)（Keuskal－Wallis法等）。計(jì)數(shù)資料組間比較采用卡方檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 兩組大鼠血漿脂聯(lián)素水平變化 缺血再灌注造模后，血漿脂聯(lián)素水平較造模前降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表1。

表1 腦缺血再灌注造模前后APN水平（ ±s） ng/m L

表1 腦缺血再灌注造模前后APN水平（ ±s） ng/m L

組別 n 造模前 造模后A組8 12.09±2.54 12.11±3.00 B組 8 12.25±4.14 7.43±3.321）2）

2.2 兩組大鼠頸動(dòng)脈脂聯(lián)素的表達(dá) 免疫組化圖片背景為紫藍(lán)色，脂聯(lián)素陽性表達(dá)在血管壁，呈棕褐色。血管壁纖維和內(nèi)皮細(xì)胞著色。免疫組化結(jié)果顯示：造模后血管壁脂聯(lián)素的陽性表達(dá)強(qiáng)度（2＋）弱于造模前（3＋）。

3 討 論

脂聯(lián)素是脂肪細(xì)胞分泌的一種脂肪細(xì)胞因子，由Scherer等［3］于1995年首先從鼠的脂肪細(xì)胞分離出來，1999年Arita等［4］將其命名為脂聯(lián)素。近年來研究發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素不僅與肥胖、胰島素抵抗、糖尿病密切相關(guān)，還在動(dòng)脈粥樣硬化過程中起著重要的調(diào)控作用。與心腦血管病等多種疾病密切相關(guān)。

低脂聯(lián)素水平參與腦梗死的發(fā)病過程，與頸動(dòng)脈粥樣硬化有一定關(guān)系，尤其與不穩(wěn)定斑塊形成密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，急性缺血再灌注大鼠造模后血漿脂聯(lián)素水平和頸動(dòng)脈內(nèi)膜脂聯(lián)素表達(dá)均低于造模前（P＜0.05）。脂聯(lián)素可能通過以下幾個(gè)方面預(yù)防缺血性腦卒中的發(fā)生：抑制單核細(xì)胞黏附血管內(nèi)皮細(xì)胞；抑制血管平滑肌增殖遷移［5］；抑制巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞的轉(zhuǎn)化［6］；增加脂肪酸氧化，降低三酰甘油、游離脂肪酸含量［7］，改善脂肪代謝，發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。因此，脂聯(lián)素有可能成為腦梗死的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測因子，為防治缺血性腦卒中提供理論依據(jù)，針對血漿脂聯(lián)素水平降低的治療可能有助于降低腦梗死的預(yù)防和治療。

［1］李志.針刺對急性腦梗死合并血脂異?；颊哐降挠绊懀跩］.中醫(yī)藥學(xué)刊，2006，24（4）：744.

［2］顧國軍，黃振興，陶凱忠，等.HBO－1對內(nèi)皮素－1誘導(dǎo)的大鼠局灶性腦缺血模型的療效觀察［J］.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，27（10）：1134－1137.

［3］Scherer PE，Williams S，F(xiàn)ogliano M，etal.A novel serum protein similar to Clq，produce dexclusively in adipocytes［J］.J Biol Chem，l995，270（45）：26746－26749.

［4］Arita Y，Kihara S，Ouchi N，etal.Paradoxical decrease of an adipose specific protein radiponectin，in obesity［J］.Biochem Biophys Res Commun，1999，257（1）：79－83.

［5］Arita Y，Kiahara S，Ouchi N，etal.Adipocyte－derived plasma protein adponectin acts as a platelet－derived growth factor－BB binding protein and regulates growth factor－induced common postreceptor signal in vascular smooth muscle cell［J］.Circulation，2008，105（24）：2893－2898.

［6］Yokota T，Oritani K，Tckahashi I，etal.A diponeetin，a new member of the family of soluble defense collagens，negatively regulates the growth of myelomonocytic progenitors and the functions of macrophages［J］.Blood，2007，96（5）：1723－1732.

［7］Betowski J.A diponection and resistin－new hormones of white adipose tissue［J］.Med Sci Monit，2005，9：RA55－RA61.